过表达KLF17对结直肠癌细胞SW480血管生成拟态以及体外侵袭能力的影响

陈华涛，瞿紫微，孟庆彬，肖新波，赵春翔

(武汉市第一医院 胃肠外科，湖北 武汉 430022)

结直肠癌已经成为仅次于肺癌和乳腺癌的第3种对人类健康造成严重威胁的常见恶性肿瘤[1]。我国结直肠癌的发病率和死亡率逐年升高，且约20%的患者会发生癌症的转移[2]。血管生成拟态是近年来在部分恶性实体肿瘤中提出的一种新型供血循环系统，其存在对肿瘤的发生、侵袭和转移等具有重要调节作用[3]。结直肠癌中血管生成拟态已经被证实，且发生血管生成拟态的肿瘤具有更强的增殖和转移侵袭能力[4]。血管上皮钙黏附素(vascular endothelial cadherin, VE- cadherin)、基质金属蛋白酶- 2(matrix metalloproteinase 2, MMP- 2)和粘连蛋白5γ2链(laminin5γ2,LN- 5γ2)的表达对肿瘤细胞血管生成拟态具有重要调节作用[5]。Krüppel样因子(Krüppel like factors，KLFs)是一类在羧基端有3个C2H2锌指结构，具有调节细胞分化、增殖以及凋亡的转录因子[6]。已有研究证实，KLF17通过调节肿瘤细胞的增殖和分化参与多种上皮性肿瘤的发生，调节肿瘤细胞的侵袭和转移[7]。本研究通过检测转染KLF17过表达质粒后人结直肠癌细胞SW480中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的基因和蛋白表达水平以及SW480细胞体外侵袭能力，探究KLF17对结直肠癌细胞血管生成拟态以及体外侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

SW480细胞由本实验室提供，PIRES- EGFP质粒购自武汉华联科生物公司，KLF17重组表达质粒PIRES- EGFP- KLF17由本实验室自行构建。胎牛血清和DMEM完全培养基购自南京建成生物工程研究所。Trizol购自北京艾德莱生物公司，逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自TAKARA公司。KLF17抗体购自Santa Cruz公司，LN5γ2、VE- cadherin、MMP- 2抗体分别购自Chemicon公司、R&D公司、Abcam公司。

1.2 细胞培养

SW480细胞培养于添加10%胎牛血清的DMEM培养液中，于95%O2、5% CO2、37 ℃培养箱中培养，待细胞生长至贴壁后使用0.3%胰酶消化和传代。

1.3 基因转染实验

采用电转法将PIRES- EGFP- KLF17转入SW480细胞。在转染之前使用0.3%胰酶消化细胞，显微镜下调整细胞浓度至1×105个·μl-1。将PIRES- EGFP- KLF17以及细胞悬液加入4 mm电转杯中，混合均匀后冰浴10 min。电转条件为450 V电压、500 mu电容。电转结束，再冰浴10 min，然后将细胞转至每孔含1 ml DMEM培养液的24孔板中，置于37 ℃培养箱中培养。以未转染重组质粒的SW480细胞作为对照。

1.4 Real- time qPCR检测mRNA的表达水平

收集转染重组质粒后培养12、24、48和72 h的细胞，用Trizol裂解液裂解细胞并进行细胞总RNA的提取，使用反转录试剂盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行单链cDNA的合成。采用Primer Premier 5.0进行荧光定量PCR，引物由天一辉远生物公司设计合成，引物序列见表1。荧光定量PCR反应体系为：2×SYBR Premix Ex TaqTM 9 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，cDNA溶液1 μl，DEPC H2O 9 μl；95 ℃预变性30 s；95 ℃ 20 s， 60 ℃ 15 s， 72 ℃ 20 s， 40 个循环。定量结果使用△△Ct法处理。

表1qPCR引物序列

基 因上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') KLF17TAGTAAAGGGGATGGT-GCGACTCACACCCTAGCCAAAGCCVE-cadherinCTGTCTACTCTTATCCCTT-GGTTTGTCAGTGTATCTACATCCT-GAMMP-2GGCATCCAGGTTATCGGGGACCATGTACGTTGCTATC-CAGGLN-5γ2GATCGAGAATCCTGACATT-GAGGAGCTGATATCTGAATCT-CACGAPDHCGACCACTTTGTCAAGCTCAAGGGGTCTACATG-GCAACTG

1.5 Western blotting 检测蛋白表达水平

取转染重组质粒后培养48 h的细胞进行总蛋白的提取，使用BCA kit对蛋白进行定量。每组取30 μg蛋白进行SDS- PAGE电泳，将表达产物转移至PVDF膜上，随后将封闭后的膜用一抗4 ℃孵育过夜。最后将膜用缓冲液冲洗2次，并用二抗在室温条件下孵育2 h。

1.6 转染前后细胞侵袭能力的检测

将50 μl Matrigel和150 μl RPMI 1640培养基加入到Transwell小室滤膜中，待细胞生长至对数生长期时使用胰酶消化，使用RPMI 1640培养基对细胞进行重悬并调整细胞浓度为1×105个·ml-1。Transwell小室上室中接种10 μl细胞悬液，下室加入等量常规培养基，37 ℃培养24 h后用4%多聚甲醛对细胞进行固定后行Gimsa染色，最后在显微镜下观察转移细胞并进行计数和拍照。

1.7 统计学处理

采用SPSS 18.0进行统计学分析，数据采用均数±标准差表示，行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 KLF17表达水平变化

KLF17转染SW480细胞24 h开始KLF17 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01，图1A)，说明KLF17已经成功转染入SW480细胞中且能够正常表达。重组质粒转染48 h后KLF17蛋白表达水平与基因表达水平是相符的，显著高于对照组(P<0.01,图1B)，进一步说明了KLF17成功转入SW480细胞，并能够正常表达。

与对照组相比，aP<0.01

图1转染后SW480细胞KLF17表达量变化

2.2 血管生成拟态相关基因的表达

与对照组相比，转染KLF17后结直肠癌细胞SW480中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的mRNA表达水平在24 h开始显著降低(P<0.01，图2)。Western blotting结果显示，转染KLF17 48 h后SW480细胞中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的蛋白表达水平显著低于对照组，与48 h时mRAN表达水平一致(图3)。

2.3 KLF17基因转染对SW480细胞侵袭能力的影响

Transwell结果表明48 h后实验组和对照组均有细胞穿出微孔滤膜(图4)。对照组和实验组显微镜下计数穿膜细胞数分别为(135.33±10.97)个和(84.67±12.66)个，过表达KLF17后SW480细胞的体外侵袭能力显著降低(P<0.05)。

与对照组相比，aP<0.01

图2血管生成拟态相关基因mRNA表达变化

与对照组相比，aP<0.01

图3KLF17转染48h后SW480细胞中各基因蛋白表达变化

A．对照组；B. 实验组；C. SW480细胞的体外侵袭能力变化统计图

与对照组相比，aP<0.01

图4显微镜下观察3组SW480细胞体外侵袭能力

3 讨 论

早期发现的结直肠癌患者在切除原发肿瘤治疗后，约40%的患者在5年内会出现腹腔局部复发或者肿瘤转移现象[8]。肿瘤细胞的转移已经成为肿瘤难以治愈的重大问题之一。在肿瘤发生和细胞转移过程中，肿瘤血管的形成具有重要调节作用。KLF17作为近年来新发现的抑癌基因广泛引起人们的关注，但其对癌症的抑制作用机制研究仍相对匮乏，且大多数研究集中在KLF17对肿瘤细胞的增殖和侵袭转移方面。KLF17对肿瘤细胞血管拟态形成的影响也应该引起我们的重视。

本研究通过检测转染过表达KLF17重组质粒的人结直肠癌SW480细胞中血管拟态形成相关基因的表达以及SW480体外侵袭能力，探究KLF17过表达对结直肠癌SW480细胞血管生成拟态以及侵袭能力的影响。过表达KLF17的SW480细胞中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的mRNA和蛋白表达水平在转染24 h后显著低于对照组，我们推测KLF17可以通过下调血管生成拟态相关基因的表达，抑制结直肠癌细胞血管生成拟态的形成。Maniotis等[9]在对葡萄膜黑色素瘤微循环的研究中发现，具有侵袭性的葡萄膜黑色素瘤细胞可以通过自身变形和基质重塑形成一种由细胞外基质界定的微循环血液流通管道，即血管生成拟态。迄今为止，研究发现血管生成拟态在多种肿瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胶质细胞瘤以及胃肠道肿瘤等细胞中存在[10- 12]。肿瘤细胞血管生成拟态的形成能够促进上皮细胞向内皮细胞转化，VE- cadherin作为内皮细胞跨膜黏附蛋白可以通过促进内皮细胞排列形成管状空腔诱导血管生成，促进血管发育成熟[13]；MMP- 2和LN- 5γ2是侵袭性黑色素瘤细胞形成血管样通道所必须的[12]。VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的表达水平降低，说明结直肠癌细胞血管生成拟态形成受到抑制，阻碍肿瘤的发展以及细胞的转移。

本研究通过Transwell实验也证实，过表达KLF17的SW480细胞侵袭能力显著低于对照组，表明KLF17可以抑制结直肠癌细胞的侵袭，这与KLF17阻碍结直肠癌细胞血管生成拟态形成是相符的。肿瘤血管生成拟态的形成导致血管上的肿瘤细胞易于脱落而直接进入血管内，从而促进肿瘤细胞发生广泛血道转移[13]。血管生成拟态在结肠癌中的研究报道屡见不鲜，血管生成拟态的发生与肿瘤的发展以及侵袭转移相关，且发生血管生成拟态的患者中位生存期更短[14]。因此，阻碍肿瘤细胞血管生成拟态的生成途径成为肿瘤治疗的重要手段之一。本研究结果显示，KLF17可以通过调控血管生成拟态形成相关基因及蛋白的表达，抑制肿瘤细胞血管生成拟态的形成，从而遏制肿瘤的发展以及侵袭转移。

综上所述，本研究结果表明，KLF17可以抑制SW480细胞的侵袭以及通过下调结直肠癌血管生成拟态相关基因的表达而阻遏其血管生成拟态的形成，为进一步研究KLF17在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。