膀胱癌组织SENP1表达变化及其临床意义

杨旭东，陈晓，张勇

(1首都医科大学附属北京天坛医院，北京100050；2北京大学肿瘤医院)

晚期膀胱癌由于丧失了手术时机，而且对传统放化疗不敏感，患者往往预后较差。分子靶向治疗是目前肿瘤治疗的热点。血管内皮生长因子(VEGF)信号传导通路是肿瘤血管生成、肿瘤生长及转移的关键限速步骤，故目前开发的抗肿瘤血管生成药物多以VEGF为靶点。舒尼替尼、帕唑帕尼和贝伐珠单抗是目前临床常用的靶向治疗药物，对肾癌、结直肠癌及肺癌等均具有良好的治疗效果[1～3]。但其对膀胱癌的治疗效果仍不明确，可能存在肿瘤血管生成调控通路的上游或旁路调控因子影响靶向药物的敏感性。缺氧是恶性实体肿瘤的一个重要特征[4，5]。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧细胞中活性增强，其作为VEGF的上游调控因子，能够激活VEGF的转录活性，从而促进肿瘤血管生成[6，7]。有研究证实，HIF-1α及VEGF均可参与膀胱癌血管生成[8]。在缺氧状态下，SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)可通过调控HIF-1α的小泛素化修饰，保证其在肿瘤细胞中高表达与高活性[6]；但SENP1又是HIF-1α及VEGF的重要上游调控因子。由此推测，SENP1可能在膀胱癌肿瘤血管生成中具有重要作用。本研究观察了膀胱癌组织SENP1表达变化，并分析其与HIF-1α、VEGF表达及患者临床病理参数的关系，旨在探讨其在膀胱癌发生、发展中的作用及其机制。现报告如下。

1 临床资料

选择2008年5月～2016年3月在北京大学肿瘤医院接受手术治疗的膀胱癌患者130例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。其中，男76例、女54例，年龄26～83(54.9±11.7)岁；2004年WHO膀胱肿瘤病理分级：低度恶性倾向22例，低级别57例，高级别51例；2002年UICC膀胱癌临床分期：T1期96例，T2期30例，T3期4例；生长方式：浸润性生长59例，非浸润性生长71例；发病状态：初发87例，复发43例。本研究经北京大学肿瘤医院医学伦理委员会批准，患者或其家属均知情同意。

2 方法与结果

2.1 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或确切概率检验。相关性分析采用Spearman相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 膀胱癌组织SENP1、HIF-1α、VEGF表达检测 取手术切除的膀胱癌组织130例份及其相应的癌旁组织(距肿瘤边缘>1 cm，并经病理检查证实为正常组织)80例份。所有组织标本经4%甲醛固定12 h，梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片。切片经二甲苯浸泡脱蜡，梯度乙醇水化，95 ℃柠檬酸盐修复液修复抗原。自然冷却至室温，3%过氧化氢孵育10 min，封闭内源性过氧化物酶。山羊血清封闭2 h，阻断组织与一抗的非特异性结合。然后分别加入兔抗人单克隆SENP1抗体(稀释比1∶100)、兔抗人单克隆HIF-1α抗体(稀释比1∶200)小鼠抗人单克隆VEGF抗体(稀释比1∶200)，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗或山羊抗小鼠IgG二抗(稀释比均为1∶50)，室温孵育30 min。DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。采用双盲法由两位病理科主任医师独立阅片。结果判定：SENP1、HIF-1α阳性染色定位于细胞核或细胞质，呈棕黄色颗粒，VEGF阳性染色定位于细胞质，呈棕黄色颗粒。每张切片随机选取5个400倍视野，评估阳性染色程度；计数200个细胞，计算阳性细胞比例。染色程度评分：淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞比例评分：≤10%计1分，>10%～50%计2分，>50%～80%计3分，>80%计4分。SENP1、HIF-1α、VEGF阳性表达以染色程度计分和阳性细胞比例计分综合判定，二者评分之和>3分为阳性表达[9]。结果显示，膀胱癌组织及癌旁正常组织SENP1阳性表达率分别为59.23%(77/130)、11.25%(9/80)，二者比较P<0.01。

2.3 膀胱癌组织SENP1、HIF-1α、VEGF表达与患者临床病理参数的关系 见表1。

表1 膀胱癌组织SENP1、HIF-1α、VEGF表达与患者临床病理参数的关系

注：由于临床分期T2、T3期数较少，统计结果为这两期合并后与T1期的比较。

2.4 膀胱癌组织SENP1表达与HIF-1α、VEGF表达的关系 Spearman相关分析显示，膀胱癌组织SENP1阳性表达与HIF-1α、VEGF阳性表达均呈正相关关系(r分别为0.338、0.494，P均<0.01)。

3 讨论

持续广泛的新生血管生成是恶性肿瘤无限制侵袭性生长的基础[10，11]。VEGF和HIF-1α是促进恶性肿瘤血管生成最重要的生长因子。VEGF是一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂素，通过与其特异性受体结合，引起一系列信号传导，刺激血管内皮细胞增殖和血管通透性增加，从而促进新生血管生成[12]。HIF-1是一种异质二聚体蛋白质复合物转录因子，HIF-1α是其功能亚基，也是惟一的氧分子调节亚单位，决定着HIF-1的活性。HIF-1α能够调控包括VEGF、胎盘生长因子及血小板源性生长因子等促进血管生成的因子[13]。由于肿瘤组织血管生成过程中促血管生成因子表达过剩，导致肿瘤血管无论是在结构上还是在功能上均不正常[14]。因此，尽管肿瘤组织血管丰富，但其灌注不平衡、氧供不充分；缺氧状态能够促进HIF-1α活性，而通过靶向药物抑制VEGF介导的血管生成，可加重肿瘤组织微环境的缺氧状态并促进HIF-1α活性，进一步激活其他下游靶基因，从而导致肿瘤进展及耐药[15]。

SENP1是一类调控SUMO修饰逆反应的酶蛋白家族重要成员[16]。SUMO是广泛存在于真核生物中高度保守的类泛素蛋白，可通过与底物蛋白共价连接可逆性修饰靶蛋白，具有调节靶蛋白细胞定位和功能的作用[17]。在缺氧状态下，SENP1的去SUMO化作用能增加HIF-1α的稳定性及转录活性[6]，其作用机制：一方面由于蛋白酶体活性受到抑制，HIF-1α不能像在常氧状态下通过依赖蛋白酶体的途径降解；另一方面，缺氧可促使HIF-1α向细胞核内移位，并促使其发生SUMO化。实际上，SUMO修饰提供了另一种信号，促使HIF-1α与VHL结合并发生泛素修饰，从而介导SUMO修饰后的HIF-1α降解。但通常情况下，缺氧诱导产生的SUMO化大多能被SENP1去SUMO化，从而维持HIF-1α在缺氧条件下的稳定性及转录活性。此外，SENP1还是HIF-1α的调控靶基因，二者之间的正反馈作用能够提高肝癌的干细胞特性并促进肝癌发生[18，19]。在前列腺癌组织中SENP1高表达，并与前列腺癌的侵袭和复发有关；抑制高级别转移性前列腺癌细胞中SENP1表达，可影响HIF-1α及其信号通路中下游MMP-2、MMP-9的骨重构能力，进而抑制前列腺癌细胞骨转移[20]。在骨肉瘤细胞中同样检测到SENP1表达，在缺氧条件下SENP1通过调控HIF-1α表达，促进骨肉瘤细胞增殖、侵袭及上皮间质转化[21]；而通过调控HIF-1α表达，可使SENP1诱发卵巢癌对铂类化疗药物耐药[22]。上述研究表明，SENP1能够通过调控HIF-1α在恶性肿瘤的发生、进展中发挥重要作用。

本研究结果显示，膀胱癌组织SENP1阳性表达率明显高于癌旁正常组织，提示膀胱癌的发生与SENP1有关。本研究中低度恶性潜能与低级别膀胱癌组织SENP1阳性表达率比较无明显统计学差异，但低度恶性潜能及低级别膀胱癌组织SENP1阳性表达率均明显低于高级别膀胱癌组织，提示SENP1可能在膀胱癌的进展中发挥作用。本研究结果显示，临床高分期(T2、T3期)、浸润性生长及复发状态的膀胱癌患者癌组织SENP1阳性表达率均明显高于临床低分期(T1期)、非浸润性生长及初发状态者，其HIF-1α、VEGF阳性表达率亦呈上述趋势，提示SENP1及HIF-1α、VEGF均参与了膀胱癌的进展。本研究相关分析发现，膀胱癌组织SENP1阳性表达与HIF-1α、VEGF阳性表达均呈正相关关系，提示SENP1促进膀胱癌进展可能与调控HIF-1α及其下游的VEGF有关。

综上所述，膀胱癌组织SENP1高表达可促进膀胱癌的发生及发展，其机制可能与上调HIF-1α、VEGF表达有关。