两株草莓灰霉菌拮抗菌的鉴定及抑菌作用研究
2018-11-02赵慧军康雅娟李建鹏李志忠
赵慧军 康雅娟 李建鹏 李志忠
1. 兰州职业技术学院，甘肃、兰州，730000；2.兰州理工大学，甘肃、兰州，730000
引言
灰霉病是由半知菌亚门、葡萄孢属的灰葡萄孢菌侵染引起的植物病害[1]，其分生孢子萌发侵染性强、可感染多种果蔬，引起植株枯萎、根部及果实腐烂、茎秆坏疽[2]，不仅严重危害果蔬的生长，也影响果蔬运输过程中的防腐保鲜。当前灰霉病的防治主要采用化学防治为主，配合农业防治措施，辅以使用微生物菌剂，但不可避免的环境污染、健康问题及作物病虫害抗性等日益严重[3]。
随着灰霉病生物防治 的广泛深入研究，植物病害生物防治的优势凸显，尤其是其生态效益和安全性。研究发现，绿色木霉孢子悬液、罗伦隐球酵母细胞、放射腐霉、地衣芽孢杆菌、荧光假单胞菌等生防菌都能有效的抑制草莓灰霉菌的生长及侵染[4]。芽孢杆菌由于其对热、紫外线、辐射和化学药剂的强耐受性和抗性[5]，及其在工业、农业、医药研究领域的广泛应用引起关注，研究表明，芽孢杆菌作为植物体内常见内生细菌，其抗菌物质可拮抗多种植物病原菌。植物病原菌在不同的地域及生长环境中表现出不同的致病性及遗传学，因此，从靶向区域作物根际土壤微生态系统中筛选优势拮抗菌，更能实现生物防治的靶向性及长效性[5]。
甘肃省兰州市红古区作为绿色农产品产业化示范区，土壤气候条件适合多品种草莓种植。本实验通对红古区花庄镇草莓标准化生产基地的调查采样，从感染灰霉病的草莓果实、根际土壤中分离得到芽孢杆菌26株，通过抑菌实验筛出对草莓灰霉菌具有较强抑菌和拮抗作用的芽孢杆菌，并进行菌种诱变得到2株具有稳定抗病能力的菌株，通过生物学特征检测和分子鉴定，为后续草莓灰霉病的生物防治提供了研究基础[5]。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验中植物病原菌草莓灰葡萄孢菌（Botrytis sp. isolate NO_9）由课题组从兰州市花庄镇河咀村草莓种植基地(103°07′23.93″E，36°12′16.36″N)灰霉病高发区病果中分离鉴定保藏。拮抗菌HZ12和 HZ02从兰州市花庄镇河咀村草莓种植基地灰霉病高发区病果根际土壤分离纯化保藏。
1.2 试剂
牛肉膏蛋白胨平板培养基；牛肉膏液体培养基；马铃薯培养基；DNA提取试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）；DNA 电泳上样缓冲液（日本TaKaRa 公司）；Taq 酶（日本TaKaRa 公司）；100 DNA Ladder Marker（北京艾德莱生物科技有限公司，DM1001）；琼脂糖（西班牙Biowest 公司）；DNA 胶纯化试剂盒（购自AXYGEN 公司）；引物（invitrogen）。
1.3 试验方法
1.3.1 拮抗菌的形态观察
将拮抗菌接种到牛肉膏液体培养基，35℃，160r/min发酵培养12h,用无菌水制备菌悬液，稀释后涂布平板，35℃培养12h,观察单菌落形态。
1.3.2 拮抗菌的生理生化检测
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[7]、《常见细菌系统鉴定手册》[8]和《微生物鉴定手册》[9]对拮抗菌进行生理生化指标检测。
1.3.3 拮抗菌分子鉴定
拮抗菌的DNA提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒，PCR扩增16srDNA,采用25µl扩增体系（见表1-2）。回收扩增片段，委托南京钟鼎生物技术有限公司完成测序。
表1 PCR 反应体系的组成
表2 PCR 反应程序
1.3.4 拮抗细菌对草莓灰霉菌抑菌作用研究
1.3.4.1 拮抗菌对草莓灰葡萄孢菌的抑菌作用
将拮抗菌置于液体培养基中，37℃摇床160r/min震荡培养24h。发酵液12000r/min离心10min，上清液用0.22µm细菌过滤器过滤制备无菌滤液；分离得到的菌体用无菌生理盐水洗涤3次制成菌悬液备用。挑取培养5d的灰霉菌丝接种到PDA平板培养基中心，25℃恒温培养12h后进行抑菌试验[10-11]。
采用杯碟法进行抑菌活性测定：PDA平板培养基放置3个牛津杯，分别加入100µl拮抗菌发酵液、拮抗菌发酵无菌滤液、拮抗菌菌悬液。25℃恒温培养48h后侧抑菌圈[12-13]。
1.3.4.2 拮抗菌对草莓灰霉病菌丝的破坏作用
对灰葡萄孢菌正常生长菌丝和对峙生长边缘菌丝制备样品[14］，扫描电镜观察。
1.3.4.3 拮抗菌对草莓灰葡萄孢菌分生孢子萌发的抑制作用
将培养5d的灰霉平板用0.3%吐温80洗脱收集孢子，配置浓度为1.0×106个/ mL的孢子悬液，各取200µl孢子菌悬液和800µL细菌发酵滤液液加入EP管中充分震荡，对照组取200µl孢子菌悬液和800µL无菌水；分别25℃恒温培养24h后观察孢子萌发状态，统计孢子萌发率[15]。
2. 结果与分析
2.1 拮抗菌的形态特征
菌株HZ12单菌落圆形，白色不透明（图1），菌落干燥，边缘光滑，中间稍隆起，表面有褶皱（图5-6）；油镜镜检，革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，形成椭圆形中生芽孢[10]（如图3）。菌株HZ02单菌落白色不透明（图2），成片菌落呈黏稠状，表层光滑湿润，中间稍隆起，边缘不规则（图7-8）；菌体均为椭圆形、短杆状，革兰氏阳性菌，形成内生芽孢（如图4）。
图1 HZ12菌落
图2 HZ02菌落
图3 HZ12菌体扫描电镜
图4 HZ02菌体扫描电镜
图5 HZ12单菌落
图6 HZ12单菌落
图7 HZ02单菌落
图8 HZ02单菌落
2.2 拮抗菌的生理生化特征测定结果
如下表结果所示，菌株HZ12和HZ01均为好氧菌，均能耐受10%NaCl，接触酶、淀粉水解、明胶水解、糖醇发酵实验均为阳性；葡糖糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、甘露醇、半乳糖发酵产酸，果糖、乳糖、棉子糖不产酸。
表3拮抗菌生理生化特征测定结果
2.3 拮抗菌16rS序列分析
菌株HZ12、HZ02的DNA进行PCR扩增，得到目标条带1-2号（如图7），经测序，菌株HZ12、HZ02的序列分长度分别为1454bp、1445bp。将16s rDNA序列与Genbank中的相关序列进行BLAST比较，并采用DNAStar构建系统进化树。结果表明，菌株HZ12与 Bacillus subtilis subsp. subtilis strain DSM 10（KJ812207.1 ）序列相似度达到 99%(如图8);菌株HZ02与Bacillus amyloliquefaciens strain(KU879248.1 )相似性最高，序列相似度达到 100%（如图9）。
图8：菌株HZ1216S rDNA序列系统发育树
图9：菌株HZ0216S rDNA序列系统发育树
2.4 拮抗细菌对草莓灰霉菌的抑制作用
2.4.1 拮抗菌对草莓灰葡萄孢菌的抑菌作用
采用杯碟法检测拮抗菌株对草莓灰葡萄孢菌的抑制作用，图10显示，以无菌水为对照，菌株HZ12和HZ02具有较强的抑菌作用；发酵液抑菌试验培养3d 后，抑菌圈直径均在10-25 mm，抑菌效果较为稳定（图11-12）。如图13-14所示，抗菌发酵液、拮抗菌发酵无菌滤液、拮抗菌菌悬液对灰霉菌均有抑制作用，发酵液与菌悬液的抑制效果最好，发酵无菌滤液的抑制效果较弱。说明拮抗菌对灰霉菌的抑制作用主要来源于菌体。
图10拮抗菌对照实验
图11 HZ12菌株
图12 HZ02菌株
图13 菌株HZ12拮抗实验：A发酵液 B菌悬液C无菌滤液
图14菌株HZ02拮抗实验：A发酵液 B菌悬液C无菌滤液
表4 拮抗菌对灰霉菌的抑制作用
2.4.2 拮抗菌对草莓灰葡萄孢菌菌丝的抑菌作用
抑菌圈边缘菌丝表现出一定的畸形：菌丝变粗，扁平出现褶皱，菌丝断裂。正常培养的菌丝光滑、细长均匀。可见菌株HZ12和HZ02可抑制灰霉菌丝的生长。
图15正常生长菌丝
图16 菌株HZ12扩散培养边缘菌丝
图17 菌株HZ02扩散培养边缘菌丝
2.4.3 拮抗菌对草莓灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制作用
如图18-20所示，添加了拮抗菌发酵滤液的灰霉孢子萌发率低，菌丝生长出现畸形：多核，细胞内容物出现凝聚、空洞，菌丝粗短等。灰霉孢子在4%的PDB培养基中培养24h,萌发率稳定的保持在90%以上，平均达到94.72；添加拮抗菌发酵上清液的孢子悬液中，菌株HZ12处理的萌发率不超过14%，菌株HZ02处理的萌发率不超过18%；两株拮抗菌对灰霉孢子的萌发有较强的抑制作用。
图18 PDB孢子萌发液
图 19 添加HZ12发酵液的孢子萌发液
图20 添加HZ02发酵液的孢子萌发液
表5拮抗菌对灰霉孢子的萌发抑制作用
3. 结论与讨论
综上所述，从兰州市花庄镇河咀村草莓种植基地灰霉病高发区病果根际土壤筛选到的两株细菌，通过对分离纯化的菌株进行形态学鉴定、生物学特征及分子生物学鉴定，根据同源性比较，菌株HZ12鉴定为枯草芽孢杆菌，菌株HZ02 为解淀粉芽孢杆菌。菌株HZ12、HZ02 对灰霉均有较好的抑制作用，可致使菌丝生长出现多核、空洞，菌丝粗短，生长缓慢；灰葡萄孢子萌发率从＞90%降低到＜18%，很大程度上减少了灰霉菌的感染率。研究发现，芽孢杆菌的抗病机制主要是与致病菌竞争营养和空间位点、分泌脂肽类化合物、有机酸、水解酶等抑菌物质，诱导植物产生抗性等[16-21］。本研究将继续对两株拮抗菌发酵培养基的优化、抑菌活性物质的分离纯化，抑菌物质对灰葡萄孢菌的抑制作用机理和安全性能等方面进一步深入研究。
