橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)幼茎木材的超微结构观察

王祥军 曾仙珍 王亚杰 黄 肖 张源源 李维国

(1.中国热带农业科学院橡胶研究所，儋州 571737； 2.国家橡胶树育种中心，儋州 571737； 3.海南大学热带农林学院，海口 570228)

巴西橡胶树(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)是商业天然橡胶的主要来源[1]。我国目前橡胶树种植面积1 700多万亩，居世界第五位，然而，近些年来天然橡胶价格持续低迷，橡胶树种植的经济效益大幅下降。木材是橡胶树种植的重要副产品，中国每年可更新生产200多万立方米的橡胶木原木[2]，经济价值巨大。今后，在生产上应用木材产量更高或木材品质更优的橡胶树新品种，可有效提高橡胶树种植的综合效益。但是，由于目前橡胶树木材特性及木材形成机制等方面的研究非常匮乏，橡胶树木材性状的定向改良难以进行，导致橡胶树木材性状优良新品种的选育进展缓慢。

木材形成是一个包括维管形成层细胞增殖、次生木质部细胞特异性分化及扩增、次生细胞壁沉积、细胞程序化死亡及心材形成的连续动态过程[3～4]。沉积于次生细胞壁中的纤维素、半纤维素(木聚糖和葡甘露聚糖)和木质素构成了木材的主要化学成分[3]，三者总量约占木材干重的95%以上[5]。另外，在木材形成过程中，木材薄壁组织中往往会贮藏大量碳水化合物，主要是淀粉和糖类[6]。曾仙珍等[7]研究了不同发育时期橡胶树幼茎木材中木质素、纤维素和半纤维素的含量变化，结果表明，木质素、纤维素和半纤维素的含量在橡胶树幼茎木材发育过程中是逐渐增加的，而且木质素与纤维素的积累具有同步性。该研究揭示了橡胶树幼茎木材发育过程中主要化学组分的变化，但是与化学变化相对应的木材物理结构变化仍不清楚，因此，本研究以不同发育阶段的橡胶树幼茎木材为材料，借助扫描电子显微镜技术，对木质部细胞的超微结构进行观察，以期揭示橡胶树幼茎木材发育过程中的物理结构变化，研究结果将为橡胶树木材材性及其形成机制的研究提供一定理论参考。

在信息技术下的美术教学，教师往往提出一个问题，学生分小组进行讨论和研究，在这个过程当中，增强了学生之间的交流和彼此的友谊，使得使各小组之间感情更加融洽，遇到问题大家一起互帮互助，学习对方身上的优点，达到共同进步，从而促进学生团队合作和人际交往的能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为种植于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场九队苗圃的0.5年生热研73397(Heveabrasiliensisvar. Reyan 73397)组培苗。选择顶蓬叶物候为古铜期、长势基本一致的植株，分别取取树皮颜色为浅绿色、绿色，以及树皮半木栓化和完全木栓化的幼茎，仔细剥离树皮，用单面刀片切成厚度约0.5 cm的薄片，分别标记为LGw、Gw、SSw和Sw样品。

1.2 实验方法

1.2.1 扫描电子显微镜(SEM)观察

SEM观察发现，幼茎木材邻近髓心组织的木质部细胞中存在一类薄壁细胞(图2)，该类型细胞在木质部逐渐发育成熟的过程中，细胞加增厚现象不明显，胞间填充物质的积累也较少，即使在木质部最成熟的Sw样品中，该类型细胞在三个细胞交接位置仍可见明显的胞间空隙(图2D)。

1.2.2 总淀粉含量测定

（2）分析问题的能力:能够结合其他学科和数据结的基本原理来识别、表达、研究分析非数据处理问题，以获得有效结论。

以上观察表明，随着木质部逐渐发育成熟，细胞内填充的淀粉粒的数量和体积也在逐渐增长。我们对不同发育阶段幼茎木材中的淀粉含量进行了测定，结果表明，从LGw到Sw阶段，木材中淀粉的含量整体上呈增加趋势(图7)。LGw样品中的淀粉含量极低(小于0.000 09%，超出了方法的最低检出限，数值以0代替)，Sw样品的淀粉含量较SSw稍有降低，但差异不显著(P>0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段幼茎木材的外观及显微结构

卢布尔雅那是一座喜爱“龙”的城市，不过这条“斯洛文尼亚龙”和我们的“中国龙”长得可不一样——它有一对大大的翅膀。在古城内的建筑上，经常可以看到以“龙”为元素的装饰物，而最著名的“龙”，是始建于20世纪初的龙桥——这座城市的象征之一。

共搜集文献561篇，其中Pubmed 146篇，Cochrane Liberary 297篇，EMBASE 118篇。筛除重复文献121篇；研究者仔细阅读题目及摘要，剔除非药物研究38篇、综述类14篇、非临床研究等419篇；剩余的文献阅读全文做进一步筛选，排除非罗马诊断标准等7篇，最终纳入文献14篇［10‐23］。

图1 橡胶树不同发育阶段幼茎及其木材的外观，以及木材横切面的显微结构 A.树皮为浅绿色的幼茎发育阶段；B.树皮为绿色的幼茎发育阶段；C.树皮半木栓化的幼茎发育阶段；D.树皮完全木栓化的幼茎发育阶段 X.木质部；P.髓心；V.导管Fig.1 The morphology of rubber tree young stem and wood developing in different stages,and the microstructure of the wood’s transverse section A. The developing stage of young stem with light green bark; B. The developing stage of young stem with green bark; C. The developing stage of young stem with semi-suberization-stage bark; D. The developing stage of young stem with the suberization-stage bark X. Xylem; P. Pith; V. Vessel

图2 不同发育阶段幼茎木材薄壁细胞的细胞壁形态 A. LGw样品；B. Gw样品；C. SSw样品；D. Sw样品Fig.2 The morphology of the cell wall of the wood parenchyma cells in rubber tree young stem developing in different stages A. The wood sample of young stem with light green bark(LGw); B. The wood sample of young stem with green bark(Gw); C. The wood sample of young stem with semi-suberization-stage bark(SSw); D. The wood sample of young stem with the suberization-stage bark(Sw) The same as following figures and tables.

2.2 幼茎木材发育过程中的细胞壁加厚

样品制备参考银永安等[8]的方法，并稍作改动。幼茎木材薄片用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH=7.0～7.4)清洗，以清除脏物，并保持木材组织的渗透压。清洗后的木材薄片用2.5%戊二醛固定12 h，然后置于冰箱中冷藏1～2 h。取出样品，逐级采用不同浓度梯度的乙醇溶液进行脱水处理，乙醇浓度梯度依次为20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%，每级浸泡处理30 min，重复3次。脱水后的样品用叔丁醇置换乙醇，浸泡30 min，重复3次，然后置于CO2真空冷冻干燥仪中干燥。干燥后的样品用单面刀片切成可供观察的横切、纵切和弦切薄片，离子溅射法喷金镀膜后，在S-3000N型扫描电子显微镜(Hitachi，日本)下观察拍照，加速电压10 kV。观察部位为幼茎木材邻近髓心组织的木质部细胞。

通过SEM观察，我们发现淀粉粒在细胞内的积累与填充是橡胶树幼茎木材发育的一个显著特征。淀粉粒主要在木射线细胞内合成与积累，但是在一些薄壁细胞中偶尔也发现有淀粉粒填充。在LGw样品的发育阶段，木质部各类型细胞内均未观察到淀粉粒填充(图6A)。在Gw样品的发育阶段，可观察到木射线和部分薄壁细胞内出现淀粉粒填充，但这一发育阶段的淀粉粒体积较小，形状较不规则，体形不饱满(图6B)。在SSw样品的发育阶段，淀粉粒体积较明显膨大，体形饱满，绝大部分呈规则的梨形，松散分布于细胞腔内(图6C)。在Sw样品的发育阶段，细胞内填充的淀粉粒数量明显增多，几乎填满整个细胞腔，淀粉粒之间发生挤压变形，体积缩小，但密度应会增加(图6D)。绝大部分细胞中均会积累较多数量的淀粉粒，但是我们也发现，有的细胞中只填充了1个胶囊状的淀粉粒(图6E)。

在较为成熟的橡胶树幼茎木质部细胞中，均可发现纹孔。纹孔的排列方式主要有散生(图5A)、网状(图5B)、梯状(图5C～D)和单串状(图5E)等类型。散生排列纹孔的特点为：纹孔散生，椭圆形，无规律排列，大小不一，网隔较纹孔宽或近等宽；网状排列纹孔的特点为：纹孔直径大小不一或大致相等，网隔较纹孔窄。梯状排列纹孔的特点为：纹孔的长度远大于其宽度，近似长方形，纹孔呈规则的梯状排列。另外，我们也发现，有的梯状排列纹孔的外缘界线明显(图5C)，而有的梯状排列纹孔外缘界线不明显(图5D)。单串状排列纹孔比较少见，该类型纹孔的排列方式类似于梯状排列纹孔，但纹孔的形状为近椭圆形，纹孔长度略大于其宽度。散生和网状排列的纹孔主要存在于导管侧壁，而梯状和单串状排列的纹孔主要存在于木纤维侧壁。从图5也可以看出，橡胶树幼茎木材细胞内壁的很多纹孔具有纹孔膜残留。

图3 橡胶树不同发育阶段幼茎木材木射线的细胞壁形态 A. LGw样品木射线的细胞壁；B. Gw样品木射线细胞壁；C. SSw样品木射线细胞壁；D. Sw样品木射线细胞壁 PCW+ML.初生细胞壁和胞间层；S1.次生细胞壁S1层；S2.次生细胞壁S2层；S3.次生细胞壁S3层 粗箭头所示为细胞角隅区Fig.3 The morphology of the cell wall of the wood ray in rubber tree young stem developing in different stages A. LGw sample; B. Gw sample; C. SSw sample; D. Sw sample PCW+ML. Primary cell wall and middle lamella; S1. Secondary cell wall layer S1; S2. Secondary cell wall layer S2; S3. Secondary cell wall layer S3 The boldfaced arrows indicated the cell corner among wood ray cells

图4 橡胶树幼茎木材管状分子细胞壁的螺纹加厚 A.单螺旋的加厚螺纹；B.双螺旋的加厚螺纹；C.四螺旋的加厚螺纹；D～E.加厚螺纹受到外力作用扭曲断裂的形态Fig.4 The morphology of the spiral thickness of the cell wall of tracheary elements in the young stem wood of rubber tree A. The onefold screw thickening thread; B. The twofold screw thickening thread; C. The fourfold screw thickening thread; D-E. The distortion and fracture morphology of thickening threads suffering external forces

图5 橡胶树幼茎木材管状分子中的纹孔 A.导管侧壁散生排列的纹孔；B.导管侧壁网状排列的纹孔；C.管胞侧壁外缘界线明显的梯状排列纹孔；D.木纤维侧壁外缘界线不明显的梯状排列纹孔；E.木纤维侧壁单串状排列的纹孔Fig.5 The pits of tracheary elements in the young stem wood of rubber tree A. Scattered pits on the lateral wall of vessels; B. Reticular pits on the lateral wall of vessels; C. Ladder-shaped pits with clear outer boundaries on the lateral wall of tracheids; D, Ladder-shaped pits without clear outer boundaries on the lateral wall of wood ray cells; E. Pearl-like pits on the lateral wall of wood ray cells

通过SEM观察，我们发现橡胶树木材管状分子(导管、木纤维等)细胞壁的加厚方式主要是螺纹加厚(图4)。加厚螺纹的螺旋方式存在差异，有单螺旋(图4A)、双螺旋(图4B)和四螺旋(图4C)等不同类型，而且不同螺旋方式可以存在于同一个管状分子中(图4A～B)。另外，橡胶树幼茎木材管状分子的加厚螺纹与其附着的外部壁层并非完全紧密粘连，在受到外力作用时，螺纹层容易与外部壁层剥离，某些情况下，会导致螺纹扭曲断裂(图4D～E)。

2.3 幼茎木材管状分子中的纹孔

从图3可以看出，木射线细胞在橡胶树幼茎木质部发育成熟过程中存在明显的细胞壁加厚现象。在Sw样品的发育阶段，可以清晰地看到细胞的复合胞间层(由初生壁和胞间层组成，PCW+ML)以及次生壁S1、S2、S3等壁层结构(图3D)。在LGw、Gw和SSw三个样品的发育阶段，木射线细胞角隅区有明显的空隙(图3A～C箭头所示)，而在Sw样品的发育阶段，大部分木射线细胞角隅区的空隙已经消失(图3D)。

2.4 木质部细胞内的淀粉粒填充

(4)北京水电勘察设计处利用砂土相对密实度对砂土液化的判别和实际有一定出入，只有地面最大加速度一个指标限制显然不能完全反映客观实际，通过日本新舄与阿拉斯加瓦尔德兹两地相对密度比较，低的非液化反而高的液化，就说明了这一点。

图6 橡胶树幼茎木质部细胞中的淀粉粒 A. LGw样品木质部细胞内的淀粉粒形态；B. Gw样品木质部细胞内的淀粉粒形态；C. SSw样品木质部细胞内的淀粉粒形态；D. Sw样品木质部细胞内的淀粉粒形态；E. Sw样品木质部细胞中的胶囊状淀粉粒Fig.6 Starch granules in xylem cells of rubber tree young stem A. LGw sample; B. Gw sample; C. SSw sample; D. Sw sample; E. Capsule-shaped starch granule in the xylem cell of Sw sample

图7 橡胶树不同发育阶段幼茎木材中淀粉含量(鲜重)Fig.7 Starch contents in the wet wood of rubber tree young stem developing in different stages

采用Megazyme总淀粉测定试剂盒(K-TSTA/14，Megazyme公司，爱尔兰)提供的方法测定和计算橡胶树幼茎木材中的总淀粉含量，总淀粉含量以单位鲜物质中淀粉占比表示。

橡胶树热研73397的幼茎树皮具有典型的阶段发育特征(图1)，当新抽生节间幼茎的叶片物候为古铜期时，树皮颜色为淡绿色，叶片物候为成熟期时，树皮颜色为绿色。随着幼茎生长，树皮继续发育成熟。从外观上看，树皮发育依次经历浅绿色(图1A)、绿色(图1B)、半木栓化(图1C)和完全木栓化(图1D)4个典型阶段。我们根据树皮发育的四个阶段对橡胶树幼茎木材进行分别取样，木材样品依次标记为LGw、Gw、SSw和Sw样品，4个发育阶段的木材外观形态差异明显(图1)，说明幼茎木材的发育与树皮发育具有同步性。从木材横切面可以看出，LGw样品的木质部与髓心在外观上尚无法明显区分，从显微结构来看，这一发育阶段木材的横切面绝大部分为细胞体积较大、排列疏松的髓心组织，木质部细胞体积小，排列致密，但仅有1～2个导管直径的厚度，而且导管数量较少(图1A)；Gw样品木质部与髓心在外观上已可明显区分，但横切面大部分仍为髓心组织。从显微结构可以看出，在这一发育阶段木材横切面的木质部中，导管组织所占的面积比例较大(图1B)；SSw样品木材横切面的木质部比例明显超过髓心，从显微结构来看，在这一发育阶段的木质部中，导管组织所占横切面的面积比例明显低于Gw样品(图1C)；在Sw样品横截面中，绝大部分为木质部，从木材横切面的显微结构来看，在这一发育阶段的木质部中，导管组织的面积比例继续降低，木纤维和木射线等非管状组织的比例明显高于SSw、Gw和LGw样品(图1D)。

2.5 木质部细胞内的附着物

SEM观察发现，橡胶树幼茎木质部细胞内及细胞内的填充物表面存在多种类型的附着物。导管加厚螺纹的表面会附着一些粘膜状物质(图8A)或颗粒状物质(图8B实心箭头所示)，而某些导管的内壁则附着有大量颗粒状物质(图8B空心箭头所示和图8C)。细胞内壁(图8D)及其填充物(如淀粉粒，图8F)表面也附着有大量粘膜状物质，这些物质可能是蛋白质，而颗粒状物质可能是脂类分子。另外，我们发现某些细胞纹孔处会附着一些丝状物质(图8E)，可能是纤维物质。

图8 橡胶树幼茎木质部细胞内的附着物 A.导管加厚螺纹表面的粘膜状附着物；B.实心箭头示导管加厚螺纹表面的颗粒状附着物；空心箭头示导管内壁的颗粒状附着物；C.导管内壁的颗粒状附着物；D.木质部细胞内壁的粘膜状附着物；E.管胞纹孔处的丝状附着物；F.淀粉粒表面的粘膜状附着物Fig.8 Attachments on the surface of xylem cell wall in rubber tree young stem A. Attachments like mucosa on the thickening thread surface of vessel; B. The solid arrow indicated granular attachments on the thickening thread surface of the vessel, and the hollow arrow indicated granular attachments on the inner surface of the vessel; C. Attachments like mucosa on the inner surface of the vessel; D. Attachments like mucosa on the inner surface of the xylem cell; E. Linear attachment in the area of tracheid pits; F. Attachments like mucosa on the surface of the starch granule

3 讨论

次生细胞壁加厚是纤维素、半纤维素和木质素合成与沉积的结果，也是木材形成的关键步骤[3]。我们在研究中清楚地观察到橡胶树幼茎木材发育过程中木质部细胞次生壁加厚的现象，这是纤维素、半纤维和木质素含量增加的物理反映，进一步验证了曾仙珍等[7]的研究结果。次生细胞壁的形成和加厚是木质部细胞成熟的体现[9]，我们研究发现，即使在非常幼嫩的LGw发育阶段，靠近树皮部分的木质部也已形成了大量的成熟木质部细胞，说明橡胶树木材形成自茎发育的起始阶段已经开始。

我们发现，橡胶树幼茎木材细胞壁加厚明显的组织为木射线、导管和木纤维。橡胶木为热带木材，一般认为热带木材导管缺乏螺纹加厚，螺纹加厚一般多存在于具单穿孔或单穿孔和梯状穿孔同时存在的木材导管中[10]，但是我们发现橡胶树幼茎木材导管细胞壁的加厚方式为螺纹加厚，未观察到其他加厚方式，而且未观察到导管中存在单穿孔，这说明了橡胶木作为热带木材的特殊性。

在橡胶树的次生生长过程中，木材薄壁组织的细胞腔内会积累大量的淀粉[11]，据报道，在烘干的橡胶树成龄新鲜木材中，淀粉含量可达7.5%～10.2%[12]。我们的研究表明，橡胶树幼茎木材中的淀粉含量随木质部发育成熟而不断增加，形态上表现为木射线和薄壁细胞内的淀粉粒体积增大。在光合产物供应不足时，木材中积累的贮藏性淀粉可作为橡胶树生长与胶乳再生所需碳源的必要补充[13]。木材中的淀粉对于木材加工既有不利的一面，也有有利的一面。一方面，较高含量的淀粉使得橡胶木容易遭受真菌滋生和昆虫蛀蚀的危害，影响木材的耐久性，这也是橡胶木易腐的主要原因之一；另一方面，在橡胶木热改性处理时，淀粉糊化能够延迟木材细胞壁的热降解，使改性橡胶木的性能更加接近未处理时的初始状态[11]。

在木质部发育成熟过程中，次生细胞壁加厚往往不均匀，未加厚部分便形成纹孔和纹孔膜[14]。纹孔膜是细胞壁复合胞间层的一部分，主要由纤维素嵌入在半纤维素和果胶的多糖基质中组成[15]。纹孔膜是纹孔结构的重要组成部分，在物质横向运输过程中具有阀门的作用[16]。我们观察发现，橡胶树幼茎木质部细胞侧壁存在大量纹孔，而且多数纹孔仍存在较多的纹孔膜残留，说明半年生的橡胶树幼茎仍处于木材发育的早期阶段，而这种纹孔特征对幼茎木材形成所需前体物质的运输是否具有特定意义仍需进一步研究确定。

构成过腔的乐音数量可多可少，可以是单音，亦可以是多音的，由此构成的过腔之长度亦有长有短。以此，过腔可以分为单音型和多音型两类。

橡胶树幼茎木材仍处于持续发育的阶段，虽然木质部细胞的原生质体已消失，但细胞内仍然存在着旺盛的生命活动。通过SEM观察，我们发现木质部细胞内壁附着有大量粘膜状物质，这些物质可能是催化纤维素、半纤维素、木质素和淀粉合成，并参与木材物理结构形成调控的蛋白质，这些推测还需要进一步的分子生物学实验验证。另外，我们发现橡胶树幼茎木质部导管内壁存在大量颗粒疣状附着物，豆科林木山合欢和象耳豆[17]、茉莉[18]以及杜英、猴欢喜、国槐、水黄皮等杜英科林木[19]次生木质部导管内壁也存在类似的颗粒疣状附着物，这种导管壁微观结构可使管壁表面积增加，提高其水亲合力，增加管内水分的内聚力，提高导管输导水分的有效性[20～21]。

木材的微观结构对其输导能力、力学特性和加工性能具有重要影响，但是目前木材形成机制的研究多集中于木质部细胞分化和木材主要成分的生物合成[3]，木材微观结构的形成机制研究较少。木材微观结构的形成涉及到纤维素、半纤维素和木质素在次生细胞壁形成过程中的交互作用，木质素与纤维素或半纤维素中的多聚糖通过共价键、氢键或范德华力连接在一起，形成木质素—碳水化合物复合体[22]。在这一复合体中，组成半纤维素主要成分的木聚糖在结合到细胞壁纤维素上的时候采用了一个扁平带状双螺旋的构象[23]，这很好地解释了橡胶树木质部管状分子次生壁双螺旋增厚的现象。但是，我们也发现木质部管状分子次生壁的增厚存在单螺旋和四螺旋等其它模式，这说明木聚糖与纤维素的结合还存在其它构象。另外，同次生壁的螺纹增厚一样，橡胶树木质部管状分子侧壁纹孔的排列方式也具有高度模式化的特点，不同的纹孔排列模式可能会影响木质部营养物质的横向运输效率，但是目前纹孔排列的机制仍不清楚。

目前，毛果杨[24]、酿酒葡萄[25]、苹果[26]、麻疯树[27]、可可树[28]、中国白梨[29]、梅[30]、夏橙[31]、桃[32]、椰枣[33]、非洲油棕[34]、无油樟[35]、枣树[36]、玫瑰桉[37]、巴西橡胶树[38]、核桃[39]、柑橘[40]、榴莲[41]、甜樱桃[42]、野生油橄榄[43]、橡树[44]等木本植物已完成了全基因组测序，这为深入揭示木材结构形成的机制提供了有力支撑。今后，应结合橡胶树木材微观结构的表型数据，并借鉴其他木本植物的研究结果，对橡胶树基因组进行深入挖掘，寻找木材结构形成的关键调控基因，以用于橡胶树木材材性性状的定向遗传改良，加速橡胶树优良木材品种的育种进程。