铁皮石斛多糖对慢性萎缩性胃炎大鼠的作用及其分子机制研究
2018-11-02欧阳一鸣李临海龙亚新王文荣
欧阳一鸣，凌 平，李临海，龙亚新，朱 宇，王文荣
(云南省第一人民医院，昆明 650000)
慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)的主要病理改变为黏膜腺体萎缩、变薄、炎症，可伴有肠腺上皮化生及不典型增生。发病率占全部慢性胃炎的10%～20%[1]，世界卫生组织已将其列为胃癌前状态[2]。
铁皮石斛是一种名贵中药材，《神农本草经》曰“主伤中；除痹，下气；补五脏虚劳赢，强阴，久服厚肠胃”，可滋阴益胃、清热生津。铁皮石斛含有多糖、黄酮、生物碱等成分。研究发现铁皮石斛多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、增强免疫等作用[3]。在对主药为铁皮石斛的铁皮枫斗晶的研究中发现，该药能促进大鼠分泌胃液，增加胃酸、胃蛋白酶的排出量[4]。本研究使用铁皮石斛多糖干预慢性萎缩性胃炎模型大鼠，旨在初步探讨铁皮石斛中的多糖成分所起到的作用及其分子机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
SPF级Wistar大鼠120只，5～6周龄，雌雄各半，体重160～180 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK-(沪)2017-0008]。实验动物均饲养于云南省第一人民医院屏障实验室内[SYXK(滇)2014-0017]，每12 h明暗交替，福利伦理审查编号：20160512。
1.2 主要试剂与仪器
铁皮石斛粗多糖高剂量：生药含量为0.5 g/mL；铁皮石斛粗多糖中剂量：生药含量为0.25 g/mL；铁皮石斛粗多糖低剂量：生药含量为0.125 g/mL，以上药物均由云南省第一人民医院中药房提供。养胃舒：每袋10 g(合肥神鹿双鹤药业有限公司)。
甲醛溶液(上海凌峰化学试剂有限公司)；MNNG(上海蓝季生物公司)；ELISA试剂盒(上海美旋生物技术公司)；Trizol、反转录试剂盒、qPCR试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)。
RM2235病理切片机、EG1150C生物组织冷冻机、EG1150H生物组织包埋机(德国莱卡公司)； BX41OLYMPUS显微镜、Nikon ECLIPSE Ti 显微摄像系统(日本OLYMPUS公司)； PCR仪(美国ABI Veriti)；荧光定量PCR仪(美国ABI StepOnePlus)；核算蛋白质定量仪(美国ThermoNanoDrop 2000)；Bio-rad电转槽(美国BIO-RAD公司)；电泳槽(上海天能科技有限公司)；37℃恒温培养箱(美国Thermoscientific公司)。
表1 PCNA、TNF-α基因的引物序列
1.3 实验方法
1.3.1 分组及模型的建立
120只大鼠根据体重随机分为正常组、模型组、铁皮石斛多糖高剂量组、铁皮石斛多糖中剂量组、铁皮石斛多糖低剂量组、养胃舒组，每组20只。模型组、铁皮石斛多糖高剂量组、铁皮石斛多糖中剂量组、铁皮石斛多糖低剂量组、养胃舒组，给予167 μg/mL MNNG饮用液(装入500 mL黑色水瓶中，自由饮用)，正常组自由饮用蒸馏水，造模8周。在病理组织学检查确定造模成功后，根据参考文献给药[5]，铁皮石斛多糖高剂量组每日灌胃给予铁皮石斛多糖提取物生药量1.34 g/kg；中剂量组0.67 g/kg；低剂量组0.335 g/kg。养胃舒组每日灌胃给予养胃舒颗粒4.0 g/kg。模型组给予生理盐水灌胃。正常组不予干预。给药12周后，对6组大鼠进行腹腔麻醉，取出胃组织，固定并浸泡在福尔马林中保存。
1.3.2 病理组织学检查
光镜观察：①胃黏膜炎症情况：采用半定量法[6]；②胃黏膜腺体厚度：随机选择胃窦部黏膜5个视野，测出每个视野下胃窦黏膜腺体厚度，取其平均值(μm)；③胃黏膜腺体数：100倍镜下，找到胃窦的腺体数，以“个/毫米”为单位；④主细胞、壁细胞数：400倍镜取5个视野平均值。
石蜡包埋，切片，采用HE染色法进行组织学检查。
1.3.3 血清GAS、IL-6的检测
参照酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测试剂盒说明进行操作。
1.3.4 PCNA、TNF-α mRNA的检测(RT-qPCR检测)
RNA提取：选取总RNA提取试剂提取总RNA。采用IPP 6.0图像分析软件测定PCNA、TNF-α mRNA。引物序列见表1。
1.3.5 Western Blot法检测JAK2、STAT3、p-STAT3的表达
①蛋白样品提取；②BCA蛋白定量；③制样；④配分离胶；⑤配浓缩胶；⑥上样；⑦电泳；⑧转膜；⑨封闭；⑩孵育一抗；孵育二抗；采用IPP 6.0分析处理影像。
1.4 统计学方法
2 结果
2.1 体重变化
正常组，铁皮石斛多糖高、中、低剂量组、养胃舒组的体重均高于模型组(P< 0.05)。铁皮石斛多糖高、中剂量组体重高于养胃舒组(P< 0.05)。(见表2)
2.2 病理学观察
模型组炎症等级高于正常组(P< 0.01)，而腺体数量、腺体厚度、主细胞数量、壁细胞数量低于模型组(P< 0.05)。铁皮石斛多糖高、中、低剂量组，养胃舒组的炎症等级、腺体数量、腺体厚度、主细胞数量、壁细胞数量较模型组均有恢复(P< 0.05)。与养胃舒组比较，铁皮石斛多糖高、中剂量组的主细胞数量增长(P< 0.05)；铁皮石斛多糖高剂量组的壁细胞数量增长(P< 0.05)。(表3)
正常组大鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，腺上皮与腺管间分界清楚，固有层偶见淋巴细胞和粒细胞；模型组大鼠胃体部和胃窦部粘膜可见一定量的淋巴细胞和粒细胞，部分粘膜肌层下见淋巴细胞灶，炎症评分较高；铁皮石斛多糖高剂量组大鼠胃窦部粘膜可见散在的淋巴细胞和粒细胞，部分粘膜肌层下偶见淋巴细胞灶，炎症评分略高于正常组，但低于模型组；铁皮石斛多糖中剂量组大鼠胃窦部粘膜可见一定量的淋巴细胞和粒细胞，炎症评分略高于铁皮石斛多糖高剂量组；铁皮石斛多糖低剂量组大鼠胃窦部粘膜可见一定量的淋巴细胞和粒细胞，偶见淋巴细胞灶，炎症评分高于铁皮石斛多糖中剂量组，与养胃舒组相近；养胃舒组大鼠胃窦部粘膜可见一定量的淋巴细胞和粒细胞，粘膜肌层下偶见淋巴细胞灶。(表3、图1)
2.3 血清GAS、IL-6含量检测
正常组，铁皮石斛多糖高、中、低剂量组，养胃舒组的GAS含量高于模型组(P< 0.05)。正常组，铁皮石斛多糖高剂量组的IL-6含量低于模型组(P< 0.05)。(见表4)
表2 各组对CAG大鼠治疗12周大鼠体重疗效
注:与正常组比较，aP< 0.01，aaP < 0.01；与模型组比较，bP< 0.05，bbP < 0.01；与养胃舒组比较，cP< 0.05。下表同。Note. Compared with the normal group，aP< 0.01，aaP< 0.01. Compared with the model group，bP< 0.05，bbP< 0.01. Compared with the Yangweishu group，cP< 0.05.The same in the following tables.
表3 各组对CAG大鼠治疗12周大鼠胃组织萎缩病理观察
表4 各组对CAG大鼠治疗12周大鼠血清GAS、IL-6含量
表5 治疗12周大鼠胃组织PCNA、TNF-α mRNA基因的表达
表6 治疗12周大鼠胃组织JAK2/β-actin、p-STAT3/STAT3的表达
注：A：正常组；B：模型组；C：铁皮石斛多糖高剂量组；D：铁皮石斛多糖中剂量组；E：铁皮石斛多糖低剂量组；：F养胃舒组。
注：A：正常组；B：模型组；C：铁皮石斛多糖高剂量组；D：铁皮石斛多糖中剂量组；E：铁皮石斛多糖低剂量组；F：养胃舒组。
2.4 胃组织中PCNA、TNF-α mRNA的表达
正常组，铁皮石斛多糖高、中剂量组的PCNA、TNF-α mRNA低于模型组(P< 0.05)。(见表5)
2.5 胃组织中JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白的表达
正常组，铁皮石斛多糖高、中剂量组JAK2、p-STAT3/STAT3的表达均低于模型组(P< 0.05)。(见表6、图2)
3 讨论
CAG的成因被认为是由多因素综合作用的结果，胆汁返流、饮食、药物等是其主要影响因素[7]。从正常胃黏膜到发生癌变，需要经历慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生及异型增生等癌前阶段[8]。CAG的治疗，西医常对症处理，长期疗效欠佳，而中医以补益脾胃为主，疗效较好。我国中药资源丰富，治疗CAG的中药也是举不胜数，而石斛是其中的典型代表。石斛具有益胃生津，滋阴清热的功效[9]。《本草求真》记载石斛“入脾肾，甘淡微苦、咸平，故能入脾，除虚热”[10]。有研究认为石斛能改善CAG大鼠的胃黏膜血流量，提高其屏障功能、抑制炎症[11]。
PCNA是仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，密切反映细胞增殖的变化，其高表达表明细胞处于活跃的增殖状态。TNF-α是一种重要的炎症细胞因子，也是调节机体免疫功能、代谢过程的多功能性细胞因子。JAK2/STAT3信号通路与细胞增殖调亡有关，细胞因子与其受体接触后，激活JAK2，JAK2刺激STAT3形成p-STAT3，进入到细胞核。活化的STAT3可诱导PCNA、TNF-α的表达，推动胃癌的发生。
本实验表明铁皮石斛多糖对CAG模型大鼠具有良好的保护及逆转作用，其作用机制可能是通过抑制STAT3上游蛋白激酶JAK2活化从而抑制STAT3的活化。同时，下调PCNA、TNF-α基因的表达，从而抑制细胞増殖，以此改善CAG模型大鼠的病理状态。
综上所述，本研究初步探讨了铁皮石斛多糖的应用价值，也为CAG治疗提供了广阔的空间和方法。下一步，本课题组将寻找是否存在其他的作用通路，以期较为全面深入的探索其作用机制，为相关研究提供更多的数据支持。
