大肠埃希菌在炎症相关结直肠癌小鼠模型中对结直肠癌生长的作用

王磊 时军利 李炳庆

【摘 要】

目的：本研究探讨大肠埃希菌在炎症相关结直肠癌小鼠模型中对肿瘤生长的作用。方法：实验雄性小鼠（C57BL/6）24只按体重大小平均随机分为两组：A组：给予氧化偶氮甲烷（Azoxymethane， AOM）联合葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）制造炎症相关小鼠结直肠癌模型，B组：AOM、DSS给药方法同A组，其余时间饮用含大肠埃希菌的饮用水。均在第10周末处死小鼠，取得结直肠组织，计数肿瘤个数。结果：造模结束后A组中肿瘤计数总数为29，平均为2.90±2.183，B组总数为63，平均为9.00±3.555，两组差异显著（P<0.05）。A组成瘤率58.33%，B组成瘤率58.33%，病理均提示腺癌，两组间成瘤率无明显差异（P>0.05）。结论：大肠埃希菌在炎症相关性结直肠癌的小鼠模型中起促进肿瘤生长作用。

【關键词】 炎症性肠病；结直肠肿瘤；大肠埃希菌；肠道微生态

【中图分类号】R365 【文献标志码】

B 【文章编号】1005-0019（2018）14-024-01

E coli.promote tumorigenesis in a mouse model for colitis-associated cancer

Wang Lei，Shi Jun-li，Li Bing-qing

Department of Gastroenterology， The Affiliated Hospital Of Chengde Medical College， Chengde 067000， Heibei Provence， China

Correspondence to： Li Bing-Qing， M.D.professor， Chief，Department of Gastroenterology， The Affiliated Hospital Of Chengde Medical College， NO. 36 Nanyingzi street， Chengde city 067000， Heibei Provence，China. Libq68@sohu.com

This work was supported by Health Department of Hebei Province（NO.20150021）

Abstract：

Objective：Elevate the effection of E coli. for tumorigenesis in mouse model of colitis-associated colorectal cancer induced by azoxymethane （AOM） and dextran sulfate sodium salt（DSS）. Methods： 24 male mice were randomly divided into group A and group B according to weight. The mice in Group A received intraperitoneal administration of AOM（10mg/kg）for one time， then drunk freely 1.5-2.1% DSS at the first， fourth， seventh week for three circles， the left time drunk freely distilled water. The mice in Group B received AOM and DSS as the same as group A， then drunk water including E coli. for left time.All mice were killed at the end of the tenth week.Collected the colorectum from anus to the end of cecum， count the number of tumor. Results： The number of tumor is 29，and 2.90±2.183 averagely in group A， and 63 in total ， 9.00±3.555 averagely in group B.There is difference between the two groups（P<0.05） ， The tumor formation rate is no difference （P>0.05）， and 58.33% in group A， 58.33% in group B. Conclusion：E coli. promote tumorigenesis in mouse model for colitis-associated cancer.

Key words：Inflammatory bowel disease； Colorectal cancer；E coli.；Microbiota

前言

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，针对结直肠癌的发生、发展的相关研究越来越深，从分子生物学到基因学，其发生机制逐步被发现，其发生相关因素包括遗传 [1]、高牛肉饮食 [2]及炎症性肠病 [3]等等。此外，结直肠癌的发生、发展还与肠道微生态失调有关，有研究指出无菌环境中生长的小鼠发生结直肠癌几率增高，大肠埃希菌属及具核梭菌属含量在结肠癌组织中及结肠癌患者大便中的含量明显高于正常结肠组织及正常人大便[4-5]。本实验探讨大肠埃希菌在炎症相关结直肠癌小鼠模型中对结直肠肿瘤发生、发展的影响。

1 材料与方法

实验用小鼠为5-6周龄雄性C57BL/6小鼠（购于北京维通利华实验动物技术有限公司）24只，常规饲养一周，便于小鼠适应生活环境，后给予链霉素（浓度2.5g/L）饮用3天。按体重大小平均随机分为两组，并按照之前报道的方法制造炎症相关结直肠小鼠模型。简述如下：AOM（10mg/kg）腹腔注射1次，在第1周、第4周、第7周服用 1.5-2.1% DSS饮用水，其余时间自由服用清水。其中A组：于第10周末处死小鼠，留取全部结直肠组织，结肠组织粘膜面给予0.1%靛胭脂染色并计数肿瘤个数，组织进行甲醛固定后，行病理HE染色。实验过程中观察小鼠便血及存活情况。B组：小鼠除服用DSS饮用水外，其余时间饮用含大肠埃希菌的饮用水（大肠埃希菌于人大便中培养获得），并每日灌胃含有大肠埃希菌饮用水1ml。饮用过程中每日清洗水瓶，并更换新的大肠埃希菌饮用水，第10周末处死小鼠，标本处理同A组。实验已通过承德医学院附属医院动物伦理委员会论证。

统计学方法：计数资料采用卡方检验，计量资料记录采用均数±标准差，并采用t检验，检验标准a=0.05。采用统计软件SPSS 17.0处理数据。

2 结果

一般情况：腹腔注射AOM时B组死亡1只，第一周是服用DSS4天后两组小鼠出现便血情况，第6天A组死亡1只，B组死亡2只。第7周B组死亡2只，第8周A组死亡1只，解剖后A组小鼠结肠内未见肿瘤及出血，B组可见肿瘤生长。

两组成瘤情况：A组 7只小鼠可见肿瘤生长，成瘤率58.33%，病理提示为腺癌，B组7只小鼠均见肿瘤生长，成瘤率58.33%，两组间成瘤率差异无统计学意义（P>0.05）。A组中肿瘤计数总数为29，平均为2.90±2.183，B组总数为63，平均为9.00±3.555，两组差异显著（P<0.05）。

3 讨论

结直肠癌是世界范围内由肿瘤导致死亡的原因之一，关于结直肠癌发病机制已有相关可喜的研究报道，但具体的分子机制仍不十分清楚。结直肠癌的原因可能是多因素参与，例如遗传、饮食、炎症等，近期越来越多的研究提出其与肠道微生态密切相关。肠道菌群及其产物在维持肠道屏障功能、免疫、营养等方面起到重要作用，这些产物包括：叶酸、B族维生素、短链脂肪酸等，而这些细菌及产物是构成肠道微生态的主要因子。有研究指出肠道菌群的改变与炎症性肠病相关，进一步与结直肠癌相关 [6]。肠道微生态的改变与结直肠癌相关，这是在结肠癌的肠道内及肠道上皮中生存的肠道细菌与正常结肠不一样。研究发现了结直肠癌的病人中粪便及肠道上皮定植菌中大肠埃希菌与具核梭杆菌增加。但并不能證明是菌群改变导致结肠癌，还是结肠癌发生引起菌群变化。目前并没有证据支持具体哪个细菌是结直肠癌的致癌物 [7]。本实验从炎症相关结直肠癌小鼠模型层面探讨大肠埃希菌对肿瘤发生、发展的影响，得到的结果是服用含有大肠埃希菌的饮用水的B组小鼠发生结直肠肿瘤的个数多于A组。

上面提到结直肠癌的病因有很多，文章报道的有多种基因与结直肠癌发生有关，包括APC；IL-10、Myd88 [8]；TLR4等。同时也已有文章 [12]报道了雌激素可促进结直肠癌的形成。Stani D.Day等报道了高脂肪饮食导致的结直肠癌可能由炎症介导，本研究为探讨大肠埃希菌是否影响小鼠炎症相关结直肠癌的影响，所以为剔除上述原因干扰。干预方法仅为含有大肠埃希菌的饮用水进行灌胃及自由饮用，得到的结果提示大肠埃希菌促进结直肠肿瘤的发生发展。

结直肠癌的肠道微环境与正常肠道不同，其中包括肠道微生态。肠道微生态的改变影响着结肠癌的发生、发展。APCmin/+小鼠的证实大肠埃希菌可以促进结直肠癌的发生，但并未观察到明显的炎症反应。本实验采用野生型小鼠，制造炎症性相关结直肠癌模型，在这种模型上我们给予大肠埃希菌干预，可进一步破坏肠道微生态的平衡，模拟炎症性肠病患者肠道情况，进而得到的结果为B组肿瘤生长的数量明显多于A组，这也证实了在肠道微生态平衡破坏后大肠埃希菌数量的增加对结直肠肿瘤生长起到重要作用。有实验指出在结直肠癌中提取的大肠埃希菌11G5比在正常结肠组织中企图的大肠埃希菌K-12对结直肠癌的生长起到作用大，然而我们得到的结果是在人大便中提取的大肠埃希菌可导致更多的结直肠癌的发生，但在成瘤率上与A组无明显差异，这和文献报道一致。但是这种作用是大肠埃希菌导致的还是其产物原因，尚需要进一步研究。同时在我们的试验中我们观察到A组结直肠癌组织中及其旁见到了大量的炎症细胞聚集，这种现象与文献报道不一样，是不是说明大肠埃希菌促进肿瘤的生长是通过炎症途径，尚需进一步研究。

参考文献

[1] Powell SM， Petersen GM， Krush AJ.et al， Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis.N Engl J Med. 1993；329（27）：1982-7

[2] Fund， W. C. R.， Food， Nutrition， Physical Activity， and the Prevention of Colon Cancer： A Global Perspective，American Institute of C ancer Research， Washington， DC 2007

[3] Herszenyi L，Miheller P， Tulassay Z·Carcinogenesis in inflammatory bowel disease·Dig Dis. 2007；25（3）：267-9

[4] A. Swidsinski， M. Khilkin， D. Kerjaschki， et al， Association between intraepithelialEscherichia coli and colorectal cancer，Gastroenterology. 1998；115（2）：281-6

[5] McCoy， A N.， Araujo-Perez， F.， Azcarate-Peril， A， et al，Fusobacterium is associated with colorectal adenomas. PloS one. 2013； 8（1）：e53653

[6] Couturier-Maillard A， Secher T， Rehman A， et al， NOD2-mediated dysbiosis predisposes mice to transmissible colitis and colorectal cancer. J Clin Invest. 2013；123（2）： 700-711

[7] Sears， CL， Garrett， WS， Microbes， microbiota， and colon cancer.Cell Host Microbe. 2014； 15： 317-328

[8] Salcedo R，Worschech A，Cardone M，et a1， MyD88 mediated signaling prevents development of adenocar- cinomas of the colon：role of interleukin 18·J Exp Med. 2010；207（8）：1625-36