老年根龋患者唾液菌群多样性初步分析

杨会肖 吕胡玲 陈慧姗 吴红崑

根龋是老年人群中常见的口腔疾患，据第三次全国口腔健康流行病学调查显示，我国65～74岁的老年人群中根龋的患病率高达63.6%[1]。根龋进展迅速，治疗不及时常常会累及牙髓或根尖周组织，造成疼痛，甚至失牙，严重危害老年人的口腔及全身健康，降低生活质量[2]。目前公认的龋病致病机制为口腔菌群失衡学说[3-4]，该学说认为：某些口腔微生物产酸引起牙面环境酸化，口腔微生态环境发生改变，产酸或耐酸菌的定植增加，引起牙齿表面脱矿与再矿化过程发生失衡，导致牙体硬组织崩解和牙本质的有机基质暴露；同时，酸环境还可以活化机体内的蛋白酶导致暴露的牙本质基质不断发生降解。口腔微生物菌群的相互作用共同促进了龋病的发生及发展。

目前，已知人类口腔中存在的细菌约700种[5]，其中超过一半是用传统分离培养技术无法培养的。Preza等[6]利用克隆测序的方法对根龋牙菌斑进行研究发现，除了变异链球菌、乳酸杆菌及放线菌外，粪肠球菌、阿托波菌、欧陆森氏菌、拟溶半乳杆菌、Pseudoramibacter alactolyticus，以及丙酸杆菌属和月形单胞菌属的个别细菌株均与根龋的发生密切相关，揭示了根龋相关细菌的复杂性和多样性；但其他研究却得出了不同的结论[7-8]，因此，有必要对根龋相关细菌进行进一步的探讨。

唾液是口腔内细菌的天然载体，是形成牙菌斑的外部环境。已有的研究表明，唾液中微生物的种类决定了牙面上菌群的定植模式[9]，罹患牙周病或龋病的人群，其唾液微生物群落与健康人存在显著差异[10]；同时唾液微生物群落结构相对稳定，唾液取样简单，无痛，具有无创性，因此，常常被用于口腔微生物多样性的研究[11]。但目前这些研究多集中于儿童或中年人，且主要针对冠部龋，目前，尚未见到有关根龋与唾液微生物群落组成关系的研究。

区别于传统的培养方法，以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为基础的高通量方法如变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，可以不必对原始样本进行培养而直接提取基因组DNA，分析细菌群体在基因水平和代谢水平上的多样性，监测微生物群落的动态变化，以及发现新的口腔微生物物种等[12]。本研究采用PCR-DGGE指纹图谱技术初步探讨不同根龋状况的老年人唾液微生物群落的多样性变化，寻找根龋相关优势菌群，期望为老年人根龋的预测及防治提供一定理论依据。

1.材料与方法

1.1临床材料 随机抽样总体为参加2012年5月～2013年7月度四川大学华西医院全身体格检查的65岁以上老年人，年龄65～92岁。实验分为2组：根龋组：根龋牙面数(Root caries surface,RDS)≥1，n=10；健康对照组：n=10。根龋的诊断标准[13]为：龋损质软或皮革感，龋损位于根面上或釉牙本质界处但大部分位于根面上，包括原发龋和继发龋。总纳入标准：全身健康状况良好，精神状况正常，无长期服药史，未罹患糖尿病、高血压、舍格伦综合症等系统性疾病，未接受头颈部术后放化疗等，采样前2个月未服用抗生素，抗菌漱口液及免疫抑制剂，口腔卫生较好，牙龈健康，除根龋外，无其他明显口腔感染性疾病如牙周病、牙髓炎、口腔黏膜疾病及肿瘤等，剩余牙数大于18颗，无长烤瓷桥修复。

1.2样本采集 经四川大学华西医院伦理道德委员会批准，研究对象或其监护人在取样前均签署知情同意书。由同一名操作者于上午8时左右分别收集2组人群非刺激性全唾液2～3mL，取样前均禁水禁食，自然口含唾液数分钟后让唾液自行流入无菌EP管中，-80℃冰箱中冻存备用。

1.3 DNA的提取和PCR扩增 将唾液样本在室温下化冻，离心，收集细菌沉淀。使用Master PureTMDNA Purification Kit(Epicentre Biotechnologies公司，美国)提取唾液样本中细菌全基因DNA作为模板。选用通用引物Bac1和Bac2对细菌的16Sr RNA基因V3区进行扩增，其中Bac1引物5′端连接40bp的“GC夹”，序列如下。Bac1:5′-CGCCCG CCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCG CCC GAC TAC GTC CCA GCA GCC-3′，Bac2:5′-GGA CTA CCA GGGTAT CTA ATCC-3′，扩增产物长度约为300bp。2%普通琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.4变性梯度凝胶电泳 (DGGE)PCR扩增产物通过DCodeTMUniversal Mutation检测系统(Bio-Rad公司，美国)进行变性梯度凝胶电泳[12]。聚丙烯酰胺凝胶质量分数为8%(w/v)，变性剂浓度梯度质量分数为30%～70%。电压恒定条件下，在1×TAE缓冲液(pH 8.5)中电泳16h。电泳完成后，溴化乙锭的染色，后于凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)采集DGGE凝胶的数码图像。

1.5 DGGE凝胶图像分析 采用Quantity One1-D分析软件4.6.2(Bio-Rad公司，美国)对电泳图像进行分析。DGGE图谱进行优化处理后，识别、调整泳道及条带，进行条带配对，并对图谱中的条带进行半定量分析，采用丰富度(S)和Shannon-Wieners指数(H’)反应群落的多样性。使用非加权平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)进行聚类分析构建系统进化树。

1.6切胶回收及序列测定 选择特征性条带进行切胶回收，回收产物以Bac1/Bac2通用引物进行再富集，扩增产物送大连TaKaRa生物公司进行克隆、测序。测序结果于人类口腔微生物组数据库(HOMD，http://www.homd.org)，美国国立生物信息中心(NCBI，http://ncbi.nlm.nih.gov)和RDPⅡ数据库(Ribosomal database project，http://rdp.cme.msu.edu)中进行BLAST检索比较，一致性达到98%-100%的序列被认为具有阳性指示意义。

1.7统计学分析 使用SPSS13.0软件，采用单因素方差分析(ANOVA)比较组间丰富度(S)及Shannon-Wieners指数(H’)差异，显著性水检验标准为P＜ 0.05。

2.结果

2.1 DGGE图谱总体特征 根龋与无龋组老年人群唾液微生物群落的DGGE图谱见图1，每个电泳条带代表1个样本，同一位置水平的条带代表1种细菌的基因型。实验具有可重复性，Sorensons相似系数为0.87。两组人群唾液细菌的组成具有多样性和个体差异性，图谱表现为未见到完全相同的泳道出现。

图1 唾液菌群的PCR-DGGE图谱

3.2条带类型分析 共发现34个不同类型的条带(图2，Band type1-34)，各泳道条带数介于16～28之间，平均条带数为19.85±2.56。其中有9个条带(Band type 1,3,13,16,20,21,22,23,24)在约80%以上样品中都有出现，其中Band type3,13,16,21的检出率为100%，推测它们可能是老年人群口腔常驻菌群；6个条带在两组的分布有显著差异，其中band type 5,27,32在健康组的绝大多数样本里均能检出(检出率，5(90%)，27(90%)，32(80%))，而在根龋组检出减少(检出率，5(50%)，27(40%)，32(40%))。Band type 25在根龋组的检出率为100%，在健康组仅检出2例(检出率，20%);而band14，34在根龋检出率均达到80%，在健康组的检出频率则下降至30%，甚至更低(检出率，14(30%)，34(20%))。这6个条带分别对应图1中A,B,C,E,D,F,切胶回收后进行克隆测序。

图2 条带类型分析图

2.3多样性分析 采用丰富度(S)和Shannon-Weaver指数(H’)来分析2组人群的多样性。物种丰富度(species richness,S)是指群落所包含的物种数目，表明群落或微生态环境中物种数目的多寡[14]。本实验中丰富度以泳道中所有条带数目表示。H’的计算是基于DGGE凝胶条带的位置和条带的强度(图3)，计算公式为H′=∑piln(pi),(pi=ni/N)，其中ni为单个条带的光密度，N为所有条带的光密度[14]。老年无龋组唾液细菌的丰富度SNRC为20.90±2.92，而根龋组老年人唾液细菌的平均条带数SRC为18.80±1.69，但两组丰富度无明显统计学差异(SNRC：SRC，P=0.103)；根龋组和无龋组老年人唾液菌群的Shannon-Wieners指数(H’)则分别为2.52±0.17和2.73±0.1，两者之间的差异存在统计学意义(P＜0.05)。

图3 DGGE图谱各条带相对强度的数字化示意图

3.4 UPGMA分析 UPGMA聚类分析结果(图4)表明，除泳道16和19外，健康组内大部分样本(泳道 18，14，12，20，11，15，17，13)聚类到邻近位置，Dice’s相似系数为0.61；而根龋组除了泳道1和7外，大部分样本，(泳道2-6，8，9，10)亦聚类到邻近的不同位置，两组人群唾液微生物群落结构都表现出较高内部相似性。

图4 UPGAM系统发育树

3.5条带回切测序结果 A-F每个条带选取2个阳性克隆进行测序，得到了种属、甚至株级别的微生物信息，测序匹配度高达98%以上(表1)。异发酵乳杆菌DSM5705(Lactobacillusmalefermentans strain DSM 5705)、未获培养的真细菌属克隆clone IS017B74/IS013B55(Uncultured Eubacterium sp clone IS017B74/IS013B55)及颊纤毛菌C-1013-b(Leptotrichia buccalis C-1013-b)在根龋组检出率高于正常组；而副流感嗜血杆菌T3T1(Haemophilus parainfluenzae T3T1),奈瑟菌属11-26360(Neisseria sp.11-26360)和某种未获培养的细菌(Uncultured bacterium clone ncd2240d01c1)在正常组检出较频率更高。

表1 回切条带测序比对结果

3.讨论

根面龋是老年口腔疾患中最常见、危害较大的疾病之一，它具有广泛的流行性，临床损害的特殊性及防治的复杂性，需要特别注意。口腔微生物菌群与宿主的相互作用同口腔疾病的发生和发展密切相关，以群落和微生物生态为基础对口腔微生物菌群进行探讨不仅为理解根龋的病因学提供了新的视角，也为根龋的防治提供了新的手段。

本研究采用PCR-DGGE技术对根龋及口腔健康老年人唾液微生物群落进行总体分析，DGGE指纹图谱共获得34种不同位置的条带，直观地显示了不同个体唾液微生物的组成具有多样性及差异性。DGGE图谱分析发现，老年根龋组的口腔微生物丰富度较老年健康组有减少的趋势(组SRC=18.80±2.94；SNRC=20.90±2.51)，但差异不明显；而老年根龋患者唾液菌群的另一多样性指数-Shannon-Wieners指数(H’)(H’RC=2.52±0.17；H’NRC=2.73±0.18)则显著小于正常者。因为Shannon指数除了包括种数外，还包括各种间个体分配的均匀性(equability或evenness)。各种之间，个体分配越均匀，H’值就越大。如果每一个体都属于不同的种，多样性指数就最大；如果每一个体都属于同一种，则其多样性指数就最小，因此与丰富度的简便直观相比，Shannon指数更能真实地反映多样性，因此，我们认为老年根龋患者唾液微生物菌落多样性减少。根龋组唾液细菌的多样性较正常组有减少的趋势，这与Li等[15]的研究结果一致。而条带类型分析则发现，6个条带(band type 5,27,32,25,14,34)在两组人群唾液中均可检出，但检出频率差异较大。这些发现都再次验证了龋病的口腔菌群生态失衡学说，即龋病的发生并不是由于某种致病菌的出现或者整个口腔微生物数量增多导致，而是随着口腔微生态环境的改变，导致一部分细菌的生长繁殖被抑制，数量减少或消失，而另一部分细菌则大量繁殖，转变为条件致病菌，从而导致龋齿的发生[16]。

结合特征条带测序结果，研究发现，颊纤毛菌C-1013-b(band type25)可以在老年根龋组唾液样本中100%被检出，这与Ling等[17]针对儿童龋病患者唾液菌群的研究一致。已知颊纤毛菌可以与韦荣菌及变链菌发生共聚，作为它们黏附于牙面的支架[18]。但Preza等则发现在健康根面菌斑中纤毛菌的检出比例更高[11]。但颊纤毛菌C-1013-b是可以培养的，因此使得对它的理化性能及其与根龋的关系进行进一步探讨成为可能。已知真细菌包含较多种类，有学者指出Eubacterium saburreum可以与Veillonella spp.发生共聚帮助其黏附到牙面上导致龋病的发生[19]，但也有研究指出Eubactrium.saburreum clone GT038，Eubacterium sp.clone EI074，Eubacterium sp.clone DO016等与口腔健康密切相关[20]，提示我们不同的细菌株可能具有完全不同的生物特性，因此，有必要从基因型水平对微生物的毒力因子进行探讨。本研究发现，某种未获培养的真细菌属克隆clone IS017B74/IS013B55(band type 34)在根龋组样本中的检出率高于健康人群，这与Preza等所得出的结论一致[11]，同时这些种属级别，甚至株级别微生物信息的获得，也证实了DGGE在研究微生物多样性方面的实用性。另外，本研究首次发现了唾液中异发酵乳杆菌DSM 5705(band type 14)在根龋组唾液中的检出率亦远高于健康组。异发酵乳杆菌可以代谢葡萄糖等生成乳酸，且产酸能力较发酵乳杆菌更强[21]，其最适pH值范围为4.1-6.9，但目前其与根龋发生的关系尚未见报道。除此之外，本试验也证实了副流感嗜血杆菌T3T1(band type5)和奈瑟菌sp.11-26360(band type 32)与健康的口腔状况关系密切[21,8,10]。由于唾液微生物菌群结构的相对稳定性及唾液取样无创方便的优势，因此唾液微生物常常被作为口腔疾病检测的分子生物学标记。本文发现有6个菌株在两组人群中的分布存在明显差异，或许可以为根龋的唾液检测提供一定的理论依据。

根据聚类分析的结果，我们无法将根龋及健康老年人唾液微生物分成2个截然不同的群落，可能与本研究样本量有关，或例外样品的存在有关。由于宿主的选择作用，唾液微生物群落本身就具有个体独特性[22]。但是，本文发现健康老年人唾液微生物相似性(Dicer系数为0.61)高于根龋组，提示可能有稳定的唾液微生物菌群存在，它们对于维持老年人口腔健康十分重要。因此老年人应定期进行口腔检查及口腔卫生保健，维护良好的口腔生态平衡，保持口腔健康。