腺叶桂樱精油的抗氧化及抑菌活性研究

李敦禧 钱军 黄丹慜 郭霞 田蜜 曾冬琴

摘 要 通过水蒸气蒸馏法提取腺叶桂樱叶的精油，利用GC-MS分析了精油的化学成分，测定了精油中总多酚和总黄酮含量，并对精油的抗氧化活性，包括DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基及还原能力；以及利用生长速率法测试精油的抑菌活性。结果表明：精油中主要成分为苯甲醛，含量為38.90%；精油中总多酚含量为8.60%，总黄酮含量为3.75%。抗氧化活性表明，精油对羟基自由基的清除活性较好，半清除率为7.548 mg/mL，与对照TBHQ活性相当；DPPH自由基、ABTS自由基的清除活性和还原作用则不如对照药剂。抑菌活性表明，精油对芒果蒂腐病菌有较好的抑菌活性，抑制率为73.58%，与桉叶油活性相当。由此推测，腺叶桂樱精油可作为天然抗氧化剂和芒果保鲜剂的备选。

关键词 腺叶桂樱 ；精油 ；抗氧化活性 ；抑菌活性

中图分类号 Q949 ；R931.6 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.07.015

Abstract The essential oil was extracted from Laurocerasus phaeosticta leaves by hydrodistillation. The chemical composition of the essential oil was analyzed by GC-MS， and the total polyphenols and total flavonoids were determined. The antioxidant activities of the essential oil， including DPPH free radical， hydroxyl free radical and ABTS free radical and reducing power， were tested by using the mycelium growth method. The results showed that the main component of the essential oil was benzaldehyde with a content of 38.90%. The essential oil contained 8.60%t of total polyphenol and 3.75% of total flavonoids. The antioxidant activity test showed that the essential oil had better hydroxyl radical scavenging activity with an IC50 being 7.548 mg/ml， which was not different from that of the control TBHQ， and that the essential oil was lower in scavenging effect and reduction capacity of DPPH radical and ABTS radical than the control. The inhibitory activity showed that the essential oil had better antifungal activity against the pathogen of mango stem end rot （Botryodiplodia theobromae Pat）， with an inhibition of 73.58%， which was similar to that of the eucalyptus oil. The essential oil of L. phaeosticta could be used as a natural antioxidant and a preservative for storage of mango.

Keywords Laurocerasus phaeosticta ； essential oil ； antioxidant activities ； antifungal activities

腺叶桂樱（Laurocerasus phaeosticta）属蔷薇科桂樱属（Laurocerasus）植物，别名为腺叶野樱[1]。该植物分布在我国南部省份，如广东、云南、海南等地。据报道，腺叶桂樱为林下演替更新层树种[2-3]，在海南枫木林场林下有较多分布。其它鲜见腺叶桂樱的研究报道，但有关桂樱属植物在国内外有文献报道。如利用桂樱属植物大叶桂樱制作药酒，用于治疗月经失调[4]、骨痛[5]等；Kupeli Akkol等[6]利用活性追踪方法，从月桂樱叶的乙醇提取物中，分离到2个糖苷类化合物，显示出显著的抗炎和镇痛活性。Liyana-Pathirana[7]发现，月桂樱鲜果汁具有很强抗氧化作用，它有助于改善因氧化应激导致的退化性疾病。Guder等[8]发现，月桂樱与黑莓一样，具有很好的抗氧化活性，比化学合成的抗氧化剂活性好，由此，月桂樱的果实在土耳其被广泛食用。成分分析表明，桂樱属植物富含苯甲醛[9-10]、多酚和黄酮类[11-13]物质。

根据文献，桂樱属植物特别是月桂樱得到深入的研究，而腺叶桂樱研究报道较少。为此，本文以腺叶桂樱为研究对象，通过水蒸气蒸馏精油，并测试精油的总多酚和总黄酮含量，及其抗氧化活性和抑菌活性，期望为腺叶桂樱精油的利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

腺叶桂樱（Laurocerasus phaeosticta）采自海南省枫木实验林场（北纬19°12′15.57″，东经109°57′38.71″），经植物学专家鉴定。洗净、晾干、粉碎，过60目筛，备用。

1.1.2 供试药品

试剂：Folin-ciocalteu试剂，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），日本TCI公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS），中国索莱宝公司；没食子酸标准品和芦丁，上海麦克林生化科技有限公司；桉叶油，上海邁瑞尔化学技术有限公司；叔丁基对苯二酚（TBHQ）、过硫酸钾等其他药剂均为市售分析纯或化学纯。

1.2 方法

1.2.1 水蒸气蒸馏法提取腺叶桂樱精油

取200 g腺叶桂樱成熟的叶片，放入圆底烧瓶中，采用水蒸气蒸馏法提取精油。保持油水混合物流出速度为1～2滴/s，直到流出物由混浊变透明为止，收集500 mL油水混合物，实验重复3次，称量精油质量，根据下列公式计算精油的提取率。所得精油于4℃避光保存。

精油提取率（%）=精油质量（g）×100/200（g）

1.2.2 腺叶桂樱精油的GC-MS分析

用安捷伦7890B-7000B GC-MS技术对腺叶桂樱精油进行成分分析。色谱条件：安捷伦 HP-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 色谱柱，程序升温：60 ℃（保留2 min），6℃/min升至300℃（保留20 min）；载气：He，进样口温度：250℃，分流进样比，20∶1，传输线温度：280℃。质谱条件：EI源；电离电压：70 eV，离子源温度：250℃，扫描模式：全扫描，扫描范围：20～450 aum，进样量：1.0 μL。

1.2.3 腺叶桂樱精油总多酚含量的测定

采用Folin-ciocalteu法[14]测定腺叶桂樱精油总多酚的含量，用50%乙醇配制没食子酸（GAE）标准溶液（96、64、32、16、8和4 μg/mL）和样品溶液，取1 mL样品溶液，加入0.5 mL Folin-ciocalteu试剂和4.5 mL超纯水混匀，室温下静置5 min，然后加入1 mL 7.5 （w/V） 碳酸钠溶液，室温黑暗处理30 min，765 nm测定吸光度。50%乙醇作为阴性对照，没食子酸作为阳性对照，测定没食子酸的标准曲线。根据标准曲线方程计算样品中总多酚含量（mg GAE/g，即每克样品中总多酚的质量数）。

1.2.4 腺叶桂樱精油总黄酮含量的测定

采用文献[15]的方法测定腺叶桂樱精油总黄酮含量。用50%乙醇配制芦丁（RE）标准溶液（96、64、32、16、8和4 μg/mL）和样品溶液，在试管中，加入1 mL样品溶液和4 mL超纯水混合均匀，再加入0.3 mL 5% （V/w） 硝酸钠溶液反应6 min，接着加入0.3 mL 10%（V/w）氯化铝溶液反应6 min，加入2 mL 1M氢氧化钠溶液终止反应，最后用超纯水定容10 mL，混匀后测定510 nm处吸光度，以50%乙醇溶液作为阴性对照，芦丁作为阳性对照，得到芦丁的标准曲线，根据标准曲线方程计算样品中总黄酮含量（mg RE/g，即每克样品中总黄酮质量数）。

1.2.5 DPPH自由基清除能力测定

根据文献[16]的方法，用95%乙醇配制20 mg/mL DPPH 母液，再稀释成所需浓度使用。取0.5 mL 样品液加入到3.5 mL DPPH 溶液中。黑暗处理30 min，在波长517 nm 处测定吸光度A 值。阴性对照以同等体积的乙醇代替测试样品；阳性对照物选用芦丁。每个浓度组平行测定3次，取其平均值，测定结果以清除率（I）表示，计算公式为：

清除率I=（1-AS/A0）×100%

式中，AS—测试样品的吸光度，nm；

A0—阴性对照的吸光度，nm。

1.2.6 羟基自由基清除能力测定

参照Fenton法[17]，取2.5 mL 浓度为2 mmol/L 的FeSO4溶液和2.5 mL 浓度为6 mmol/L的双氧溶液，混匀后，加入7.5 mL浓度为6 mmol/L的水杨酸溶液，在37℃恒温水浴中处理15 min，在510 nm 处的吸光度（As）。取4.0 mL不同浓度的精油样品加入AO测定体系中，在37 ℃的恒温水浴中处理15 min后，在510 nm处测定吸光度（Ax）。以TBHQ为阳性对照，每个处理重复3次。清除率计算公式：

清除率I=（1-AS/AO）×100%

1.2.7 ABTS自由基清除能力测定

参照文献[18]的方法，配制ABTS溶液和过硫酸钾溶液，黑暗反应12～16 h，用95%乙醇稀释，使其在734 nm处的吸光度为（0.7±0.02），黑暗密封保存备用。取0.1 mL不同浓度的精油样品加入3.9 mL 上述ABTS自由基溶液，反应6 min，在734 nm处测定吸光度As，0.1 mL 50%乙醇代替样品测吸光度AO。每组试验平行重复3次。ABTS自由基清除率计算公式如下：

清除率I=（1-AS/AO）×100%

1.2.8 Fe3+还原作用（FRAP）的测定

根据文献[17]的方法，将0.1 mL的精油与3.0 mL FRAP溶液混合，37 ℃水浴5 min，取出后迅速混匀，测量混合液在593 nm的吸光度，FRAP溶液为25 mL醋酸盐缓冲溶液（300 mM）、2.5 mL10 mM三吡啶三嗪的40 mM的盐酸溶液和2.5 mL六水合三氯化铁溶液（20 mM）混合，以50 %乙醇为阴性对照，七水合硫酸亚铁为阳性对照，测定七水合硫酸亚铁的标准曲线和样品的吸光度来评价还原作用（mM Fe2+/g DW，即每克干燥样品对高价铁离子还原能力）。

1.2.9 腺叶桂樱精油对果蔬病原真菌的抑菌活性测定

香蕉炭疽病菌（Calletotrichum musae），香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、芒果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobromae）、火龙果黑斑病菌（Bipolaris cactivora），葡萄溃疡病菌（Lasiodiplodia theobromae），番茄早疫病菌（Alternaria solani）由海南大学热带农林学院提供。

抑制活性采用菌丝生长速率法测定[19]，用1.0%的吐温80溶液配制浓度为1 000 μg/mL精油母液，取2 mL母液加入到18 mL 灭菌的PDA培养基中，形成100 μg/mL精油。在PDA平板中央放靶标菌菌饼（ 5 mm），菌丝一面朝下，28 ℃培养。1.0%的吐溫80蒸馏水作为空白对照，相同浓度的桉叶油为药剂对照。72 h后（芒果蒂腐病菌培养48 h），十字交叉法测量菌落直径，按照文献[19]计算抑制率。

1.2.10 统计分析法

采用Excel软件对测定的实验数据进行统计分析，统计数据以p<0.05为显著差异水平。

2 结果与分析

2.1 腺叶桂樱精油的GC-MS分析

经计算，水蒸气蒸馏法获得腺叶桂樱精油的平均提取率为0.197%。精油的相对密度d为1.038 4，折光率n为1.502 1。将所得精油进行GC-MS成分分析，得到总离子流图（图1）。对图中的各峰进行质谱扫描，并与NIST98标准质谱数据库的标准图谱比对，根据匹配鉴定出腺叶桂樱精油中71种物质的化学成分，部分化合物未能匹配鉴定；根据峰面积归一化法计算出已鉴定的化合物在精油中的百分含量，结果见表1。

由表1可知，腺叶桂樱精油中含有各种烷烃、醇、酚、醛、羧酸、酯、甾体等化合物。其中苯甲醛含量最高，为38.90%；其次是苯甲醇，含量为10.21%，植醇的含量为6.72%。其它大部分化合物的含量不足1%。由此表明，腺叶桂樱精油中化合物的种类繁多，成分复杂。因而，腺叶桂樱精油可能呈现出许多重要的生物及药理活性。

2.2 腺叶桂樱精油中总多酚和总黄酮的含量

根据没食子酸测量结果，拟合出线性回归方程Y=0.011 7X-0.017 9（R2=0.999 1），以回归方程为参照，根据腺叶桂樱精油测得的吸光度，计算出精油中总多酚的含量为85.99 mg GAE/g，即腺叶桂樱精油中总多酚的含量为8.60%。

根据芦丁测量结果，拟合出线性回归方程为Y=0.002 4x-0.006 1（R2=0.999 6），根据腺叶桂樱精油测量的吸光度，参照芦丁标准方程，计算出精油中总黄酮的含量为37.53 mgRE/g，即腺叶桂樱精油中总黄酮的含量为3.75%。

2.3 腺叶桂樱精油对DPPH自由基清除作用

通过1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基来测量精油的抗氧化活性，结果见图2。

由图2可知，随着精油浓度不断增加，DPPH自由基清除率逐渐增大，当精油的浓度为10 mg/mL时，自由基的清除率为55.98%，而芦丁的浓度为32 μg/mL时，自由基的清除率为58.12%；根据精油和芦丁的浓度、清除率，线性拟合出回归方程，结果见表2。由表2可知，精油和芦丁的半自由基清除率（IC50）分别为7.388和0.0252 mg/mL。通过比较IC50值，精油是芦丁的293倍，由此表明，精油的抗氧化活性比标准对照芦丁的活性差。

2.4 腺叶桂樱精油对羟基自由基清除作用

根据Fenton方法，腺叶桂樱精油对羟基自由基清除率的测量结果如图3所示。随精油浓度增加，羟基自由基清除率不断增加，且不同浓度之间清除率增加幅度较大。从2 mg/mL增加到4 mg/mL，清除率增加4.69倍，从4 mg/mL增加到6 mg/mL，清除率增加7.46倍。TBHQ从0.2 mg/mL增加到0.4 mg/mL，清除率增加11.76倍。由表2可知，腺叶桂樱精油的半自由基清除率为7.548mg/mL，而TBHQ的半自由基清除率为0.443 6 mg/mL，精油的IC50值是TBHQ的17倍，根据统计分析结果，其抗氧化活性相当。

2.5 腺叶桂樱精油对ABTS自由基清除作用

根据ABTS的褪色原理，在734 nm处，测得腺叶桂樱精油对ABTS自由基清除率结果见图4。

由图4可知，随精油浓度不断增加，ABTS自由基清除率逐渐增大，当精油的浓度为6 mg/mL时，自由基的清除率为46.70%，而TBHQ的浓度为64 μg/mL时，自由基的清除率为47.52%，其自由基清除活性相当。但是，精油的浓度是TBHQ的93.75倍；由表2可知，精油和TBHQ的半自由基清除率（IC50）分别为6.361和0.0710 mg/mL。精油的IC50值是TBHQ的89.59倍，其抗氧化活性不如标准对照。

2.6 腺叶桂樱精油的还原作用

以七水合硫酸亚铁为阳性对照，通过测量精油不同浓度的吸光度来评价其还原作用，结果见图5。

由图5可知，随着精油浓度不断增加，在549 nm处，其吸光度慢慢增大，当精油的浓度为10 mg/mL时，吸光度为0.486，而七水合硫酸亚铁的浓度为16 μg/mL时，吸光度为0.5。由此表明，当精油浓度为10 mg/mL时，与七水合硫酸亚铁的浓度为16 μg/mL时的还原作用相当，但是精油浓度是阳性对照的625倍；因此，精油的还原作用比七水合硫酸亚铁的还原作用差。

2.7 腺叶桂樱精油的抑菌作用

以桉叶油为对照药剂，利用生长速率法，测试腺叶桂樱精油对6种靶标真菌的抑菌活性，结果见图6。在质量浓度为100 μg/mL下，精油对6种靶标菌的菌丝生长有较好的抑制活性，特别是对芒果蒂腐病菌，抑制率为73.58%；与对照药剂桉叶油（79.65%）无显著性差异。对番茄早疫病菌和火龙果黑斑病菌，其精油抑制率分别为55.28%、34.47%，与对照药剂桉叶油（57.78%、38.42%）也无显著性差异。对其它病菌的抑制率与对照药剂间存在显著性差异，尤其是对香蕉枯萎病菌，精油的抑制率仅为9.79%，而桉叶油的抑制率达到30.90%。由此表明，精油有较好的抑菌活性，但从广谱抑菌活性来看，精油的活性比桉叶油活性稍差。

3 结论与讨论

通过水蒸气蒸馏，从腺叶桂樱中获得精油含量为0.197%，比同属植物大叶桂樱中的精油（0.15%）含量略高[9]。GC-MS分析比较，月桂樱精油中苯甲醛含量最高，为99.7%[10]；大叶桂樱精油中苯甲醛含量为44.46%[9]；腺叶桂樱精油中最高含量也是苯甲醛，含量为38.90%。初步推断，苯甲醛为桂樱属精油的主要成分；但是大叶桂樱仅检测出10个成分，而腺叶桂樱精油中被检出71个成分。可能原因是，现在的设备较以前更加先进，色谱柱更加精密，数据库更加丰富，从而检测出的成分更多。

该精油中，总多酚含量为8.60%，总黄酮含量为3.75%。根据GC-MS分析，酚的含量合计为6.38%，少于总多酚含量。可能是方法不一样，总多酚采用Folin-ciocalteu法，利用分光光度计进行检测；而采用GC-MS检测，除直接检测到酚类物质，还用酚的衍生物，这类物质在总多酚检测中，可能都被检测，最终总多酚含量显示较高。黄酮的含量有类似总多酚的情况。Karahalil等[11]测定月桂樱果实中总多酚和总黄酮分别为10.94 mg GAE/g DW和0. 80 mg QUE/g DW；Ozturk等[13]测量贮藏期月桂樱果实的总多酚为9.44 mg GAE/g 和总黄酮0.12 mg QE/g，都比本文测量得到的总多酚总黄酮含量少；而Karabegovic等[12]发现来自不同地域的植物材料，总多酚从36.2 到119.4 mg GAE/g，总黄酮12.9到66.6 mg RE/g，该结果正好涵盖本文测量的数据。

抗氧化活性表明，腺叶桂樱精油有较好的抗氧化活性，特别是对羟基自由基的清除活性，与对照TBHQ活性相当，但是DPPH自由基、ABTS自由基的清除活性不如对照，总还原活性也比对照活性差。从文献情况来看，不同地方的月桂樱，其抗氧化活性存在显著性差异[20]；且抗氧化活性随时间延长，活性逐渐降低[13]。由此表明，桂樱属植物具有抗氧化活性，不同植物抗氧化活性可能存在一定差异。另外对照样品为专用化学抗氧化剂，而精油来自植物，属于天然抗氧化剂类别，因此，具有一定利用价值。

抑菌活性发现，腺叶桂樱精油对不同靶标真菌具有显著性差异，对芒果蒂腐病菌有较好的抑菌活性，与对照药剂活性相当；对其它病菌活性不理想。由于芒果蒂腐病菌生长速度快，2 d内直径可达5 cm左右，而精油的使用，在速效上抑制了该菌的快速生长，所以表現出较好的抑菌活性。其它病菌生长速度较慢，精油的速效性很难发挥作用，所以抑菌活性不理想。由此表明，对容易快速引起植物或果实发病的病原菌，可以使用精油进行前期处理，以便延缓病菌的扩展速度，辅助化学杀菌剂，这样将会有好的防治效果，同时能减少化学农药的使用剂量，达到减药的目的。

参考文献

[1] 陆玲娣. 中国桂樱属植物的分类研究[J]. 植物研究，1984（04）：37-59.

[2] 姚金雨，许娜子，朱宁华，等. 张家界国家森林公园生物多样性监测与森林可持续旅游对策[J]. 中南林业科技大学学报，2011，31（03）：191-196.

[3] 许 涵，黄久香，唐光大，等. 南昆山观光木所在群落优势树种的种间联结性[J]. 华南农业大学学报，2008（1）：57-62.

[4] 华 菊. 一种治疗月经不调的药物及其制备方法[P]. 发明专利，CN104958737A，2015-10-07.

[5] 黄 勇. 一种治疗骨伤的方法[P]. 发明专利， CN104547087A，2015-04-29.

[6] Akkol E K， Kirmizibekmez H， KücüKboyaci N， et al. Isolation of active constituents from cherry laurel （Laurocerasus officinalis Roem.） leaves through bioassay-guided procedures[J]. J ethnopharmacol， 2012， 139（2）： 527-532.

[7] Liyana-Pathirana C M， Shahidi F， Alasalvar C. Antioxidant activity of cherry laurel fruit （Laurocerasus officinalis Roem.） and its concentrated juice[J]. Food Chem， 2006， 99（1）： 121-128.

[8] Guder A， Korkmaz H. Investigation of antioxidant activity and total anthocyanins from blackberry （Rubus hirtus Waldst. and Kit） and cherry laurel （Laurocerasus officinalis roem）[J]. Asian J Chem， 2012， 24（10）： 4 525-4 531.

[9] 池庭飞，施小芳，黄儒珠，等. 大叶桂樱叶精油的化学成分初步研究[J]. 植物学通报，1986（Z1）：44-45，78.

[10] Stanisavljevic I T， Lazic M L， Veljkovic V B， et al. Kinetics of hydrodistillation and chemical composition of essential oil from cherry laurel （Prunus laurocerasus L. var. serbica Pancic） leaves[J]. J Essent oil Res， 2010， 22（6）： 564-567.

[11] Karahalil F Y， Sahin H. Phenolic composition and antioxidant capacity of cherry laurel （Laurocerasus officinalis Roem.） sampled from Trabzon region， Turkey[J]. Afr J Biotechnol， 2011， 10（72）： 16 293-16 299.

[12] Karabegovic I T， Stojicevic S S， Velickovic D T， et al. The effect of different extraction techniques on the composition and antioxidant activity of cherry laurel （Prunus laurocerasus） leaf and fruit extracts[J]. Ind Crop Prod， 2014， 54： 142-148.

[13] Ozturk B， Celik S M， Karakaya M， et al. Storage temperature affects phenolic content， antioxidant activity and fruit quality parameters of cherry laurel （prunus laurocerasus L.） [J]. J Food Process Pres， 2017， 41（1）： 169-171.

[14] Dranca F， Oroian M. Optimization of ultrasound-assisted extraction of total monomeric anthocyanin （TMA） and total phenolic content （TPC） from eggplant （Solanum melongena L.） pee[J]l. Ultrason sonochem， 2016， 31： 637-646.

[15] Harzallah A， Bhouri A M， Amri Z， et al. Phytochemical content and antioxidant activity of different fruit parts juices of three figs （Ficus carica L.） varieties grown in Tunisia[J]. Ind Crop Prod， 2016， 83： 255-267.

[16] 彭長连，陈少薇，林植芳，等. 用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力[J]. 生物化学与生物物理进展，2000，（06）：658-661.

[17] Zhu C H， Lei Z L， Luo Y P. Studies on antioxidative activities of methanol extract from Murraya Paniculata[J]. Food Sci Human Wellness， 2015（04）： 108-114.

[18] Thoo Y Y， Ho S K， Liang J Y， et al. Effects of binary solvent extraction system， extraction time and extraction temperature on phenolic antioxidants and antioxidant capacity from mengkudu （Morinda citrifolia） [J]. Food Chem， 2010， 120（1）： 290-295.

[19] Rebollar-Alviter A， Madden L V， Jeffers S N， et al. Baseline and differential sensitivity to two QoI fungicides among isolates of Phytophthora cactorum that cause leather rot and crown rot on strawberry[J]. Plant Dis， 2007， 91（12）： 1 625-1 637.

[20] Alasalvar C， Al-Farsi M， Shahidi F. Compositional characteristics and antioxidant components of cherry laurel varieties and pekmez[J]. J Food Sci， 2005， 70（1）： S47-S52.