毛细管电泳法分析无机阴离子实验教学的设计与探讨

刘慧青，徐中其

(东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620)

近年来，我校(东华大学)基础实验中心得到上海市化学学科建设资金资助，相继购置了一批大型分析仪器，建立了精密仪器平台，旨在推动新型仪器分析实验改革，提高实验教学水平。分析化学教研室积极开展“仪器分析”课程的教学研究与改革，以激发学生的学习兴趣，提高学生综合运用知识能力和创新能力。

一、 水质检测实验项目的教学现状

“仪器分析”作为我校化学化工与生物工程学院开设的一门专业基础课，具有很强的应用性和实践性。根据应用化学、生物工程等专业人才培养的要求，将“仪器分析”实验课程分为几大教学模块，水质检测为其中之一。它是以分析与测定环境水样中某些成分含量为目的，通过水质分析技术了解环境水质情况，为监督和控制水质质量提供依据。水质检测方法很多，根据常规水质检测项目，分为物理性质测定、金属化合物测定、非金属无机化合物测定和有机化合物测定[1]。在“仪器分析”实验教学中，水质检测模块安排了3个实验，分别为原子吸收光谱法测定水中的钙、镁含量——标准曲线法[2]，钼酸铵分光光度法测定水中总磷[3]，离子色谱法测定水样中的无机阴离子含量[4]。

二、 教学改革的目的、意义及设计

环境水样的无机阴离子测定通常采用传统的离子色谱法[5-6]。离子色谱法(IC)存在样品分析时间长、准备工作量大、仅适用于低浓度试样、分离效率低和色谱峰形差等缺点。针对离子色谱法存在的不足，本实验设计了一种快速、操作简便、试剂消耗少、柱效高的检测方法——毛细管电泳法(CE)。与离子色谱法相比，毛细管电泳法具有更高的分辨能力和分离效率[7]。另外，离子色谱法与“仪器分析”实验中常用的反相高效液相色谱法的实验原理、基本概念、仪器结构和操作方法相似，而毛细管电泳法则是在传统电泳和高效液相色谱的基础上发展起来的一种新型高效分离技术，使分析科学从微升级进入到了纳升级水平[8]。随着近几年毛细管电泳法在生物医药、环境化学、农学和食品分析等应用领域的快速发展和深入，越来越多的企业选用毛细管电泳仪作为分离分析工具。因此，本教学改革不仅能缩短实验时间、节约试剂用量和提高分离效率，而且能将毛细管电泳法引入本科实验教学中，让学生能够掌握更多的知识和技能，主动适应企业需求，提升学生就业能力。

本实验的目的是让学生理解毛细管电泳的基本原理，熟悉毛细管电泳仪的构成，了解影响毛细管电泳法分离的主要操作参数。因此，将对电泳的背景电解质(BGE)、有机添加剂、分离电压、电渗流改性剂和pH值分别进行讨论，让学生自主选出合适的毛细管电泳条件。对于自主选择色谱条件，最初学生还是有一定的畏难情绪。通过改变毛细管电泳法条件的分离参数，让学生直观感知到色谱图的变化，从而更加容易和深入地掌握相关的理论知识。学生采用自主选择的优化条件，对校内湖水和实验室未知水样进行定量分析。这种教学模式极大地促进了学生对“仪器分析”实验课程学习的主动性和积极性，培养了学生的创新能力和科研能力。

三、 水质检测实验基本内容

水质检测是大二第一学期“仪器分析”课程中水质分析设计实验，4学时。对于本科生实验教学，考察间接吸收背景物质、有机添加剂和分离电压对无机阴离子的毛细管电泳分离的影响。而研究生的水质分析设计实验为8学时，在本科生的无机阴离子毛细管电泳分析的基础上拓展部分内容，即讨论电渗流改性剂和缓冲溶液pH值对分离的影响。

1. 仪器与试剂

P/ACE MDQ型毛细管电泳仪，弹性石英毛细管柱(60 cm×75 μm，有效长度50 cm)。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、铬酸钾(K2CrO4)、丙三醇、乙醇等试剂均为国产分析纯。

阴离子标准储备液：分别准确称取适量的NaF、NaCl、Na2SO4、KBr和KNO3，用超纯水定容配成1 000 mg/L的标准储备液。实验时将储备液稀释到所需浓度。

2. 实验方法

配制一定浓度的铬酸钾溶液作背景电解质，实验前用超声波脱气。每次进样前毛细管依次用超纯水和电解质溶液冲洗，每进样4次需更换新鲜电解质溶液。采用压力进样，毛细管温度控制为25 ℃。

3. 实验过程与分析讨论

(1) 背景电解质对电泳行为的影响。紫外光度检测器是毛细管电泳法最广泛使用的检测器，它具有灵敏度高、响应速度快、高温稳定性优和价格实惠等优势。然而，大部分无机离子没有或只有很低的紫外吸收，如何用紫外光度检测器来检测？我们采用含强紫外吸收的物质作为背景电解质，当它通过检测器窗口时，出现较大的背景吸收。当无机阴离子通过紫外检测窗口时，阴离子代替背景电解质降低了背景吸光度值，出现色谱峰从而达到检测的目的。傅小芸等[9-11]考察了多种类型背景电解质对阴离子分离的影响，发现铬酸根较适合作为背景电解质来分离迁移率大的无机阴离子。铬酸根浓度的大小对检测灵敏度、阴离子的迁移时间和分离具有一定的影响。本实验中学生通过考察K2CrO4浓度为1.0～10 mmol/L时，浓度变化对迁移时间和分离效率的影响，然后学生自主选择出铬酸根的最佳浓度。当背景电解质为5.0 mmol/L左右的铬酸根时，分离度最佳。

(2) 有机添加剂的影响。在毛细管电泳的电解质体系中加入有机溶剂，能降低电解质溶液的介电常数，从而降低电渗流，延长分析时间，改善分离。本实验考察在1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4的缓冲溶液中，有、无添加混合有机溶剂对分离度的影响。在无添加有机溶剂的条件下，Br-和Cl-严重地重叠(图1中曲线A)，未能实现分离；仅添加一定量的乙醇或丙三醇，5种阴离子也不能完全基线分离；在添加混合有机物3%丙三醇和10%乙醇时，Br-和Cl-得到较好分离度，5种阴离子组分在6.0 min内达基线分离(图1中曲线B)。

图1 5种阴离子在无有机溶剂(A)和添加有机溶剂(B)条件下的电泳谱图对比峰序：缓冲体系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)；分离电压：-20 kV；样品压力进样0.5 psi×10 s；检测波长：254 nm

图2 分离电压对出峰时间的影响缓冲体系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)+体积分数3%丙三醇+体积分数10%乙醇；样品压力进样：0.5 psi×10 s；检测波长：254 nm

(3) 分离电压的影响。实验采用负电压，阴极进样，阳极检测。外加电压的改变会产生不同的电场强度和焦耳热，从而影响各离子的出峰时间、峰形和分离度。一方面，随着电压的增大，电渗速度和阴离子的迁移速度增大，出峰时间缩短，峰形变尖，柱效和分离度提高，有利于毛细管电泳法快速分析；另一方面，过高的电压使得毛细管内壁产生过多的焦耳热，导致谱峰增宽，反而降低柱效和分离度[12]。实验中考察了不同负电压(-15～-25 kV)对各阴离子出峰时间、分离度及柱效的影响，让学生绘制分离电压-出峰时间曲线图(见图2)，并计算出不同电压下的分离度和理论塔板数。通过理论塔板数的计算了解毛细管电泳法具有强大的分离效率，进而加深对平流(电泳中电渗流的流动)和层流(液相色谱中的溶液流动)驱动的理解。通过讨论不同负电压对出峰时间、峰形和分离度的影响，让学生自主摸索出最佳分离电压。一般最佳分离电压为-20 kV，在该电压下可获得良好的分离效果。

图3 校内湖水的电泳图峰序：缓冲体系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)+体积分数3%丙三醇+体积分数10%乙醇；样品压力进样：0.5 psi×10 s；分离电压：-20 kV；检测波长：254 nm

4. 实验拓展部分

(1) 电渗流改性剂的影响。毛细管电泳分离过程中，阴离子的电泳淌度大，且方向与电渗流相反，存在迁移时间长、峰形宽、分离效率低的问题。因此需要在电解质溶液中加入一定量的电渗流改性剂，利用CTAB中[H4N]+对毛细管壁表面的硅醇基团进行屏蔽，从而改变电渗流方向，实现阴离子的快速分离分析效果[13-14]。本实验中学生可配制浓度分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的CTAB，考察电渗流改性剂浓度对迁移时间、分离度的影响，从而自主选出最佳浓度的CTAB。一般采用CTAB浓度为0.5～1.0 mmol/L，完全能实现各离子的分离。

(2) 缓冲溶液pH值对分离的影响。毛细管电泳分离无机阴离子需在弱碱性条件下进行，学生配制不同pH值(7.0～9.5)的缓冲溶液，考察其pH值对阴离子分离的影响，选出最合适的pH值。发现当pH值为7.0～8.3时，随着pH值增大，各组分的迁移时间缩短，背景电解质体系不稳定，组分峰高降低，分离效率不佳；当pH值为8.4～8.9时，pH值对迁移时间的影响很小，峰形和分离度较好；当pH值大于9.0时，F-峰扩展严重，分离度减小。因此一般选择缓冲溶液的pH值为8.4～8.9。

四、 考核体系

“仪器分析”实验课程的考核简单地以实验结果作为唯一评判标准是不合适的，应该更关注和重视学生在整个实验课程中的综合表现[15-16]。实验成绩分成三部分：(1)实验前期的预习(包括毛细管电泳法理论知识、仪器操作方法、实验方案设计等)，实验准备工作的参与以及预习报告的完成情况，占20%。(2)实验过程，包括实验态度、组内合作、实验效率、操作能力、实验结果等，这部分考核是整个考核体系中的重点，占50%。为了能全面、公正地考核学生的实验过程，指导教师需要在整个实验过程中对每名学生的操作进行仔细观察并及时纠正错误操作，对学生的实验过程考核做出准确评价。(3)实验报告，包括实验目的、实验原理、仪器与试剂、实验数据及处理(包括分离电压-迁移时间曲线图和各离子标准曲线的绘制，不同电压下的分离度和理论塔板数、回归方程和实际水样含量的计算)、实验结果分析(特别是影响电泳分离的几个参数对毛细管电泳法分离的结果和讨论)、思考题，占30%。

五、 结语

以毛细管电泳法代替传统的离子色谱法，促使“仪器分析”实验课程中仪器分析手段的多元化。同时使用区别于以往的色谱分析的间接紫外检测法，让学生学会无或只有很低的紫外吸收物质的测定。通过本实验的教学改革，激发学生对“仪器分析”课程的学习兴趣，增强学生的分析能力，有利于学生的就业和发展，同时也提高了学生的科研能力，为大四的毕业设计(论文)奠定基础。