原发性血小板增多症患者钙网蛋白基因突变及其与临床疗效的相关性
2018-10-31唐君玲汤计瑞朱小凤王雪梅李晓明
丁 莉,王 季,唐君玲,马 涛,汤计瑞,朱小凤,王雪梅,李晓明
(西南医科大学附属医院血液科,四川泸州 646000)
原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)是一类以骨髓巨核细胞系终末分化细胞及外周血血小板增多为主要表现的造血干细胞恶性克隆性疾病。临床可无症状或有血管舒缩功能障碍相关表现,有发生动静脉血栓、出血、进展为骨髓纤维化或急性白血病的风险。既往的研究表明50%~60%的ET患者具有JAK2V617F突变,近年的研究发现钙网蛋白(calreticulin,CALR)基因第9号外显子突变存在于70%~80%的JAK2V617F突变阴性ET患者中[1]。有研究表明CALR基因突变常与更高的血细胞负荷及血栓事件相关[2],但目前关于CALR基因突变是否影响ET患者临床疗效的相关报导尚少见,故本研究旨在检测ET患者CALR基因的突变情况,评价其与ET患者临床疗效的相关性。
1 资料与方法
1.1一般资料 收集2014年12月至2017年6月就诊于本科室确诊为ET的61例患者(均已行JAK2V617F突变检测),诊断标准及危险分层参照WHO2008诊断标准[3]。其中JAK2V617F突变阳性(+)26例(男14例,女12例;年龄18~79岁),JAK2V617F突变阴性(-)35例(男16例,女19例;年龄21~83岁)。收集35例JAK2V617F(-)患者骨髓或外周血标本,检测其 CALR基因第9号外显子的突变情况。上述患者接受临床常规方案治疗,回顾性分析其临床资料,评估疾病缓解情况。本研究通过本院伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1CALR基因第9号外显子突变检测 (1)在患者知情同意情况下,抽取患者骨髓或外周血EDTA抗凝标本约3 mL,提取全基因组DNA (DNA提取试剂盒由天根生化科技有限公司生产),使用无菌去离子水将其稀释至终浓度 200 μg/mL。(2)PCR反应体系及循环参数。CALR基因9号外显子目标片段PCR引物由上海Invotrogen生物技术有限公司合成(正向引物5′-CTG GCA CCA TCT TTG ACA ACT T-3′;反向引物5′-GGC CTC TCT ACA GCT CGT C-3′)。反应体系25 μL:其中Taq 酶混合液12.5 μL(Takara 公司产品)、上下游引物各1.0 μL、去离子水8.5 μL、DNA模板2.0 μL。PCR反应参数:预变性94 ℃ 2 min;94 ℃变性15 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,40个总循环;72 ℃延伸1 min。(3)PCR产物检测:使用2%琼脂糖凝胶电泳初步检测PCR产物。扩增出PCR产物的样本剩余部分送Invitrogen公司纯化后,使用ABI3730DNA 测序仪 (美国应用生物技术公司) 进行双向测序。检测到突变的样本进一步送作克隆测序。
1.2.2危险分层标准[3](1)低危组:年龄小于60岁,无心血管疾病高危因素(如吸烟、肥胖、高血压、糖尿病、高血脂等),无血栓或栓塞病史。(2)高危组:年龄大于或等于60岁,且(或)有血栓或栓塞病史。 (3)中危组:介于低危与高危组之间。
1.2.3治疗方案 所有入组患者:当血小板计数大于或等于1 000×109/L时联合血小板单采,同时辅以羟基脲口服辅助降细胞以减小栓塞风险(据初治时血小板具体计数、年龄来确定起始剂量15~20 mg·kg-1·d-1)。当血小板计数小于1 000×109/L时,低危组及中危组患者单用重组人干扰素α2b(IFN-α2b,北京凯因益生公司)60 μg/d皮下注射(注射前0.5 h口服奈普生预防流感样不良反应),血小板降至正常上限开始减量为每2天1次,缓解后逐步减量至1~2次/周维持;高危组患者在使用干扰素(方案同上)时继续联合羟基脲辅助降细胞至安全范围(血小板降至600×109/L左右)后单用干扰素,血小板降至正常上限开始减量为每2天1次,缓解后逐步减量至1~2次/周维持。
1.3疗效评价标准 完全缓解:临床症状消失,血象 (白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板)恢复正常。部分缓解:血细胞计数较治疗前下降50%,临床表现有所减轻。治疗无效:达不到部分缓解者[4]。
2 结 果
2.1PCR产物电泳及测序结果 CALR基因野生型样本PCR目标产物长度377 bp,突变型长度则不等于377 bp。突变型电泳后可见双条带或较厚重模糊的单条带,提示混合型产物(图1所示)。PCR产物剩余部分送双向测序。35例JAK2V617F(-)患者中共检出18例(51.4%)CALR基因突变。包含3种类型:1型(52 bp缺失)15例(42.8%)、2型(5 bp插入)2例(5.7%)、3 bp缺失1例(2.9%)。测序提示存在突变的样本进一步送克隆测序,3 bp缺失型未克隆成功。
1、 2:野生型产物。3、5、6、7:野生型及52 bp缺失型混合产物;4、8:野生型及5 bp插入型混合产物;9:DNA分子标记物图1 部分样本PCR产物凝胶电泳结果
2.2ET患者临床特征及血液学疗效分析 JAK2V617F(+)、CALR(+)、JAK2V617F及CALR双阴性患者分别设为A、B、C组,各组间性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。B组ET患者,初诊时年龄常较其余两组年轻化,同时危险度分层相对较低(P<0.05)。经常规临床治疗后,较多的A、B组患者能获得不同程度血液学缓解,两者间差异无统计学意义(P>0.05),同时两组患者的总缓解率均较C组患者高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
3 讨 论
ET属于BCR-ABL阴性骨髓增殖性肿瘤(classic myeloproliferative neoplasm,MPN)范畴。导致MPN的恶性克隆复杂多样,其中JAK2、CALR、MPL基因突变被认为是MPN发病的使动因素,对MPN具有诊断意义。CALR已被证实可对多种细胞功能(如蛋白质折叠、胞内钙离子浓度调控、细胞增殖、分化、凋亡等过程)造成影响[5]。FALCHI等[6]、MELIKYAN等[7]的研究发现:ET患者CALR基因突变常与更高的血小板计数、更低的血栓事件及更好的总生存相关。
本研究发现CALR基因第9号外显子突变在JAK2V617F阴性的ET患者中检出率较高(18/35,51.4%) 。其中以1型(52 bp缺失)最多见,占总突变83.3%;其次为2型(5 bp插入)占总突变11.1%;与近期国内外相关研究结果相近[8-9]。同时检出1例少见的3 bp(AAG)缺失。相较于JAK2V617F(+)及双阴性的ET患者,CALR(+)的ET患者初诊时年龄更小、危险度更低,其生存、预后判断受高龄伴随其他疾病所带来的影响可能相对较小。
联合羟基脲及干扰素的常规临床治疗方案能使较多的JAK2V617F(+)及CALR(+)患者获得完全或部分血液学缓解,相较于双阴性患者总缓解率更高,这得益于具有JAK2或CALR基因突变的患者相较于双阴性患者对干扰素应答更佳。有研究表明单一的JAK2V617F突变[10-11]或CALR突变[12]的细胞对干扰素-α可保持持久的敏感性。干扰素α治疗红细胞增多症(PV)和ET的多年临床实践已证实其可清除JAK2V617F突变造血干细胞,使患者获得完全分子生物学缓解,但部分患者停药后可在分子学水平复发[13]。大多数患者仅能通过常规临床治疗获得部分血液学缓解,如何使更多患者获得完全、持续的血液学缓解甚至分子生物学缓解成为临床治疗的困难之处。
通过本次研究分析得出:CALR基因9号外显子突变是ET患者重要分子遗传学标志之一,此突变影响患者对临床治疗的应答。检测ET患者CALR基因突变有助于提高对该类患者的临床诊断、预后判断及为设定更加个性化的治疗方案提供依据,为更多患者带来福音。