FTY720-P联合同种异体骨移植修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究∗∗

邓子文，黄 东，蔡 慧，徐世明

(1.广东医科大学研究生学院，广东湛江 524023；2.广东省第二人民医院创伤显微外科，广州 510317)

骨移植是临床上最常见的移植类手术之一，全球每年有超过200万患者进行骨移植手术，在美国选用同种异体骨作为骨移植材料占总骨移植数量的1/3[1-2]。但是，大段同种异体骨移植后因感染、再次骨折、骨不连等并发症导致的远期失败率高达25%[3-4]。如何促进大段同种异体骨的骨诱导能力，降低移植后的并发症成为研究热点。FTY720是一种新型免疫抑制剂，在体内活性成分为FTY720-P，除能有效抑制免疫反应外，还具有一定的成骨作用，但机制尚不清楚[5-6]。本文拟通过动物实验探索FTY720-P联合同种异体骨修复骨缺损的效果，为该药在临床上的应用及后续研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 普通级成年新西兰大白兔40只，雄性，体质量2～3 kg，由广东省医学动物实验中心提供。

1.1.2主要仪器与试剂 FTY720-P(美国Cayman公司)，兔骨形态发生蛋白-2(BMP-2)多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，电子万能试验机(上海企想检测仪器有限公司)，BX43型显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1同种异体骨的制备 随机选取4只新西兰大白兔，采用耳缘静脉注射空气法处死，无菌条件下完整取出四肢长骨，用微型多功能电锯将取下的长骨锯成长约15 mm的骨段，1∶1甲醇和氯仿12 h脱脂，30%过氧化氢(H2O2)12 h脱蛋白，0.6 mmol/L HCl 5 min脱钙[7]后独立包装，以25 kGy60Co辐照灭菌12 h，然后将同种异体骨放入-80 ℃深低温冰箱中保存备用。

1.2.2同种异体骨移植 首先按说明书将FTY720-P配制成浓度为1 mg/mL的溶液备用。受试动物用戊巴比妥联合846合剂麻醉，右前肢桡骨中段充分暴露，用微型多功能电锯在桡骨中段建立15 mm长骨缺损模型,然后将动物随机分为A、B、C 3组，每组12只。其中A组移植用1 mg/mL FTY720-P溶液浸泡30 min后的同种异体骨，B组移植未做处理的同种异体骨，C组移植自体桡骨。

1.2.3影像学检查 术后4、8、12周各组随机抽取6只动物经耳缘静脉戊巴比妥麻醉后常规摄X线片，观察骨移植区骨痂、新骨形成情况，并采用Lane-Sandhu法[8]进行影像学评分。

1.2.4组织学与免疫组织化学检测 术后4、8、12周各组随机抽取3只动物空气法处死，完整取出右前肢桡骨，4%多聚甲醛固定24 h，乙二胺四乙酸(EDTA)法脱钙1～3周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，沿移植骨纵轴纵向行4 μm厚度组织切片，行苏木精-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色。BMP-2抗体工作浓度1∶200，二氨基联苯胺(DAB)方法显色，棕色判为阳性，对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替Ⅰ抗。

1.2.5生物力学检测 术后12周各组剩余的6只动物采用耳缘静脉注射空气法处死，然后完整取出右前肢桡骨进行三点弯曲试验。实验前先对标本移植区进行人工弯曲，若移植区不稳定或极易发生弯曲则判定为修复失败，反之继续行三点弯曲实验。将标本放于仪器上，间距30 mm，在移植骨中点位置向下加载负荷，加载速度10 mm/min，记录最大弯曲强度及位移。

2 结 果

2.1X线片观察和Lane-Sandhu评分 骨移植后第4周，A组移植骨与宿主骨交界处近端观察到骨痂形成；第8周，A组移植骨与宿主骨交界处近远端均观察到骨痂形成，且骨痂形成的量大于B组；第12周，A、C组移植骨与宿主骨间已完全融合，B组则尚未完全达到融合，见图1。在骨移植后第4、8、12周A、C组Lane-Sandhu评分均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；A、C组术后各时间点Lane-Sandhu评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.2组织学观察 术后4周，A组桡骨断端及移植骨周围可见少量炎性细胞，大量骨痂形成，主要成分为纤维组织及软骨细胞、局部见编织骨形成、伴有少量骨髓腔，纤维组织内可见较多破骨细胞及碎骨片(图3A)；B组桡骨断端周围较多炎性细胞聚集及大量纤维组织增生，局部见少量软骨细胞及少量编织骨(图3D)；C组桡骨断端及移植骨周围见大量骨性骨痂，植入体内可见少量血管(图3G)。术后8周，A组桡骨断端见少量软骨细胞及大量编织骨，移植骨内见少量血管生成，骨髓腔内形成骨小梁、可见少量骨髓(图3B)；B组移植骨与周围编织骨部分融合，融合部位植入体内可见极少量小血管(图3E)；C组桡骨断端形成大量板层骨，与移植骨融合，骨髓腔再通(图3H)。术后12周，A组桡骨断端可见大量板层骨生成，移植骨与新生的板层骨融合(图3C)；B组移植骨与新生骨组织基本融合，周围见少量板层骨(图3F)；C组移植骨骨皮质重塑，但较正常骨皮质薄(图3I)。

2.3BMP-2免疫组织化学染色 术后4周各组中BMP-2均可见阳性表达，主要表达于新生成骨质的骨陷窝、新生骨附近成骨细胞细胞质及纤维性骨痂基质内，见图4。

图1 3组骨移植后各时间点X线片

*：P<0.05，与B组比较图2 3组术后各时间点Lane-sandhu评分(n=6)

A～C：A组术后4、8、12周；D～F：B组术后4、8、12周；G～I：C组术后4、8、12周图3 3组术后各时间点组织学检查(HE×40)

2.4生物力学检测 人工弯曲实验结果显示A组、C组移植骨与宿主骨完全融合，B组部分标本移植骨与宿主骨界限仍较清晰。三点弯曲实验显示，A组修复后的桡骨最大弯曲强度大于B组(P<0.05)；与C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

*：P<0.05，与B组比较；intact：对侧正常桡骨图5 三点弯曲实验测试术后12周3组骨移植修复骨缺损后桡骨的最大弯曲强度

3 讨 论

大段同种异体骨常用于严重创伤、骨肿瘤切除后的保肢治疗，但大段同种异体骨移植后移植区域周围血供不足及远期并发症如移植骨与宿主骨骨不连(10%～30%)、持续感染(6%～13%)、二次骨折(10%～30%)[9-11]等的发生却令临床医生不尽满意，往往导致患者功能差，甚至手术失败。许多学者通过在同种异体骨上复合自体干细胞[12]、重组蛋白[13]、富血小板血浆[14]、基因治疗[15]等方法来促进大段同种异体骨移植周围微血管网的再生及异体骨与宿主骨的融合，取得一定效果。近期研究发现，局部应用1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)结构类似物FTY720可促进同种异体骨移植后移植骨与宿主骨之间的融合。

S1P是一类真核生物体内天然存在的具有生物活性的细胞膜鞘类脂质的代谢中间产物[16]，由鞘氨醇在鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SPHK)的磷酸化作用下形成，通过与S1P受体(sphingosine-1-phosphate receptor，S1PRs)结合调控多种细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、定位[17]。鞘氨醇结构类似物FTY720是一种新型免疫抑制剂，体内经SPHK2磷酸化为活性成分FTY720-P，可非选择性结合S1PRs从而发挥生物效应[18-19]。现有研究表明，FTY720/FTY720-P可趋化破骨细胞由骨表面向外周血迁移，抑制破骨细胞的形成[20-21]。同时，在切除卵巢的小鼠中，FTY720可促进其骨髓源间充质干细胞向成骨细胞分化，FTY720显著增加成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Runx2及Sp7的表达[22]。分子细胞的研究说明，FTY720/FTY720-P对骨代谢有着重要的影响。本研究在利用FTY720-P联合同种异体骨修复兔桡骨大段骨缺损的动物实验中观察到，术后12周运用FTY720-P的A组成功修复桡骨大段骨缺损，三点弯曲实验中A组修复后的桡骨生物力学强度明显大于单纯同种异体骨修复后的桡骨。术后4、8、12周A组骨痂形成的量、Lane-Sandhu评分均明显高于单纯同种异体骨修复的桡骨，可达到类似自体骨的修复效果。说明FTY720-P可促进同种异体骨与宿主骨的融合，增强其生物力学强度。

研究发现，通过连续皮下注射FTY720并不能促进鼠股骨骨折的愈合及骨缺损的修复[23]。但将FTY720以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLAGA)为支架复合在同种异体骨上修复鼠颅骨、胫骨骨缺损的实验中，发现FTY720可明显促进骨形成[24-26]。复合在同种异体骨上的FTY720随着PLAGA的降解持续在骨缺损周围释放，使得局部FTY720的浓度维持在一定范围，可促进骨缺损周围微血管网的形成及小动脉的扩张，增加骨缺损区域血供，促进骨缺损的修复[24-26]。本研究将FTY720-P通过浸泡的方法复合在同种异体骨上，增加异体骨局部FTY720-P浓度，在术后8周A组HE染色结果观察到异体骨内新生血管形成，B组仅见极少量血管。说明经FTY720-P浸泡后的同种异体骨移植后对其局部血管形成同样有一定促进作用，进而促进异体骨与宿主骨的融合。

同种异体骨移植后的免疫排斥反应同样影响其与宿主骨间的融合。而FTY720作为一种免疫抑制剂，可抑制淋巴细胞从淋巴结释放入外周血，并在临床上已应用于治疗多发性硬化症[18-19]。骨折愈合早期特征是免疫细胞侵入局部血肿的炎性反应阶段[27]。同种异体骨局部释放FTY720可明显减少移植区CD45+白细胞数量[25]。本实验中观察到术后4周B组移植骨周围见较多炎性细胞，而A组炎性细胞少见，表明FTY720-P对局部炎性反应有抑制作用，笔者推测这一作用可能是FTY720-P促进异体骨与宿主骨融合的机制之一。

综上所述，移植经FTY720-P浸泡后的同种异体骨可促进异体骨局部血管形成、降低局部炎性反应，增强异体骨生物力学强度，成功修复大段骨缺损，可达到自体骨修复骨缺损的效果，为临床降低大段同种异体骨移植后远期并发症的发生提供一种新的治疗决策。但浸泡后FTY720-P的复合效率及作用时间的确定还需进一步研究。