Ki-67和CK10在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤中的表达及临床意义∗∗

宋云韬，耿曼英

(郑州大学第二附属医院耳鼻咽喉科，郑州 450000)

鼻内翻性乳头状瘤(NIP)是鼻腔鼻窦中较为常见的良性肿瘤，因其恶变倾向及高复发率，故而常被认为是一种“交界性肿瘤”。现研究表明,NIP的发生、发展是多因素、多阶段的，与遗传、炎症刺激、细菌及病毒感染、环境因素、变态反应等均有关[1-2]。探讨NIP的发病机制，有助于NIP的早期诊断、预防和治疗。多项研究发现，细胞角蛋白10(CK10)在细胞增殖分化的过程中起重要的调控及效应作用；Ki67是一种存在于增殖细胞中的核抗原，与细胞周期密切相关，可反映细胞的增殖能力。本研究采用免疫组织化学法检测Ki-67和CK10，探讨其在鼻息肉(NP)、正常鼻腔黏膜(NM)及NIP组织中的表达情况，从而分析NIP的发病机制，并探讨二者之间的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院耳鼻咽喉科2009年1月至2014年1月收治的经病理确诊的NIP患者50例(均经鼻内镜下手术切除)，男34例，女16例；平均年龄(57.6±7.1)岁；初发37例，复发13例；癌变3例；根据Krouse分级：T1期8例，T2期11例，T3期25例，T4期6例。另选取NP组20例，男11,女9例；NM组10例，男、女各5例。所有组织标本常规石蜡包埋。本研究通过本院伦理委员会审批，患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂 鼠抗人CK10单克隆抗体，购自上海杰浩生物技术有限公司。兔抗人Ki67单克隆抗体试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。修复液枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自基因科技(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组织化学二步法 (1)组织标本常规石蜡包埋，毎例各做3张3 μm厚的连续切片，放置60 ℃烤箱中，苯二醛及乙醇脱蜡水化；(2)高压锅抗原修复：加热修复液(枸橼酸盐缓冲液)，沸腾后高压修复3 min；(3)PBS冲洗，3%过氧化氢室温20 min阻断内源性过氧化物酶活性；(4)PBS冲洗，滴加一抗4 ℃过夜；(5)PBS冲洗，滴加二抗室温50 min；(6)PBS冲洗，DAB显色，复染细胞核，水洗，梯度乙醇脱水，烤片，封片。

1.3.2结果判定 以染色强度和阳性细胞数进行综合分析,按半定量积分法判定结果。每张切片随机选取5个高倍视野(×400)进行结果判定,按染色强度计分：无色计0分,淡黄色计1分,棕黄色计2分,棕褐色计3分。按着色细胞数占同类细胞总数百分比计分：阳性细胞数小于或等于10%计0分,>10%～25%计1分,>25%～50%计2分,>50%～75%计3分，>75%计4分,以两类计分结果的乘积最终作为试验结果：0～1分判为阴性(-)，2～3分判为轻度阳性(+)，4～6分判为中度阳性(++)，>7分则判为强阳性(+++),阳性率=(轻度阳性例数+中度阳性例数+强阳性例数)/总例数×100%。

1.4统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较应用χ2检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CK10与Ki-67在NIP、NP、NM组织中的表达 CK10分布在细胞质中，呈现淡黄色、黄色、棕黄色颗粒状物质，见图1A。50例患者NIP组织中38例出现阳性染色，20例患者NP组织中8例出现阳性染色，10例对照NM组织中未出现阳性染色。NIP、NP、NM组CK10阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；且NIP组与NP组、NM组CK10阳性率比较，差异均有统计学意义(χ2=6.697，P=0.01；χ2=20.727，P=0.000)。Ki-67分布在细胞核中，呈现淡黄色、黄色、棕黄色物质，见图1B。50例患者NIP组织中30例出现阳性染色，20例患者NP组织中11例出现阳性染色，10例对照NM组织中2例出现阳性染色。NIP、NP、NM组Ki-67阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；NIP组与NM组Ki-67阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=5.357，P=0.021)，NIP组与NP组Ki-67阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.007，P=0.787)，见表1。3例癌变病例(鳞状细胞癌)Ki-67、CK10的表达水平均为强阳性。

A：CK10在NIP组织中的表达；B：Ki-67在NIP组织中的表达

表1 CK10、Ki-67在NIP、NP、NM组中的表达阳性率比较[n(%)]

2.2单纯NIP与复发NIP患者CK10、Ki-67阳性率比较 NIP组共13例患者发生复发(复发率为26.0%)，37例未复发。复发NIP组患者CK10、Ki-67阳性率均高于未复发NIP组，差异均有统计学意义(χ2=3.912，P=0.048；χ2=4.593，P=0.032)，见表2。

表2 单纯NIP组与复发NIP组CK10、Ki-67阳性率比较

2.3不同分期NIP患者CK10、Ki-67阳性率比较 NIP组患者中T1～T2期19例，T3～T4期31例。T1～T2期与T3～T4期患者CK10、Ki-67阳性率比较，差异均无统计学意义(χ2=2.771，P=0.096；χ2=0.287，P=0.592)，见表3。

2.4CK10和Ki-67在NIP组中表达的相关性 CK10与Ki-67在组织中的表达呈正相关(r=0.686，P<0.01)，见表4。

表3 不同分期NIP患者CK10、Ki-67阳性率比较

2.5NIP患者的生存情况 Ki-67阳性表达患者复发率(1-累计无进展函数)高于阴性表达患者，差异有统计学意义(χ2=119.353，P=0.000)，见图2A；CK10阳性表达患者复发率高于阴性表达患者，差异有统计学意义(χ2= 52.735，P=0.000)，见图2B；Ki-67、CK10均表达患者随诊期终末复发率为18%(9/50)，其中3例恶变，病理类型为鳞状细胞癌，高于Ki-67、CK10均不表达时复发率[2%(1/50)]，见图2C。

表4 NIP组中CK10与Ki-67表达的相关性(n)

A：Ki-67；B：CK10；Ki-67与CK10图2 NIP患者的生存曲线

3 讨 论

NIP在鼻腔鼻窦的良性肿瘤中十分常见，它起源于上皮组织，占鼻腔鼻窦肿瘤的0.5%～4.0%[3]。生长具有侵袭性、术后易复发(复发率28%～74%)、癌变倾向(恶变率为5%～15%)等特点。各年龄段均可见发病，以50～60岁男性(男∶女约为3～5∶1)高发。NIP的发病机制至今尚未明确，目前大多数研究表明，NIP的发生可能与病毒感染、炎症刺激、抑癌基因、细胞过度增殖等密切相关[4-6]。

Ki-67是一种与细胞增殖相关的核抗原，功能与有丝分裂密切相关，与细胞增殖中密不可分，与多种肿瘤的分化程度、浸润、转移及预后相关。Ki-67的过度表达与乳腺癌、肺癌、肠癌等恶性肿瘤的转移及预后密切相关[7]。在本研究中，Ki-67在NM、NP、NIP组中均有表达。从NM、NP到NIP组中，Ki-67的表达阳性率呈逐渐增高趋势，在NM组与NIP组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与孟宪影等[8]的研究结果一致。在3例癌变病例中，Ki-67的表达量明显增高，均说明Ki-67可反映NIP细胞的增殖能力，并猜测Ki-67可能参与了交界性肿瘤的恶变过程。在NP组与NIP组间比较，无明显差异，表明Ki-67的表达无明显特异性，不能表明其与NIP的发病相关。在复发与未复发NIP患者中Ki-67表达阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明NIP的复发与Ki-67的表达相关，这与BURA等[9]的研究一致。T1～T2期与T3～T4期NIP患者Ki-67表达阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明Ki-67的表达与肿瘤的临床分级无关。

CK是细胞骨架蛋白的主要成分，是在上皮细胞发生、分化、成熟过程中形成的，不同组织中表达形式不同[10]。CK10属于Ⅰ型(酸性)CK，通常表达于分化较成熟的上皮组织，是鳞状上皮分化的标志，在皮肤中研究较多，而在鼻乳头状瘤方面的研究较少。姜莉等[11]研究发现，CK10在日光性角化病中多数阳性表达，而在基底细胞癌中仅少数表达，在组织中阳性表达越高，表明分化程度越高。本研究中，CK10表达于上皮细胞的细胞质中，在NM、NP、NIP组3组中表达阳性率逐渐增强，染色强度逐渐加深；3组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且NIP组与NP组、NM组比较均有明显差异(P<0.05),表明CK10可反映细胞的增殖活性，通过上调CK10蛋白的表达，使上皮向鳞状上皮分化，从而参与NIP的发病过程。在复发与未复发NIP患者中CK10表达阳性率有明显差异，提示CK10在NIP中的高表达与NIP的复发相关，这与SHABANA等[12]的研究结果一致。CK10表达阳性率在T1～T2期与T3～T4期NIP患者中无明显差异，说明CK10表达与肿瘤的临床分级无关。本研究NIP组的复发率为26.0%，当CK10及Ki-67阳性表达时NIP的复发率高于不表达时的复发率，其表达与NIP的复发呈正相关，可作为预测术后复发的指标。Ki-67、CK10均表达时的复发率(18%)高于Ki-67、CK10均不表达时的复发率(2%)，可侧面反映二者在NIP发病过程中可能通过某种机制相关联。但肿瘤的复发可由多种因素影响，如手术方式、术后复查情况等。部分Ki-67和CK10高表达患者亦无复发，可能与随访时间较短相关，将进一步随访进行研究。

CK10与Ki-67的表达也密切相关，表明这两种免疫指标可能通过某种机制相关联。在3例NIP伴癌变组织中，病理类型为鳞状细胞癌，CK10及Ki-67的表达均为强阳性，免疫组织化学染色强度明显高于其他病理类型，猜测CK10与Ki-67可能参与了NIP的癌变过程，但由于样本量较小，不足以说明CK10及Ki-67在NIP的癌变过程中所起的作用，需进一步收集病例验证，若结果符合，可能实现新的、有效的靶向治疗。

综上所述，CK10与Ki-67可分别从细胞核内及细胞质水平反映肿瘤细胞的增殖能力，亦可能参与NIP的恶变过程，CK10在NIP发病过程中可能起到了重要作用。