Lgr5和MIF在结直肠癌患者中的表达及其临床意义分析

赵 斌，吉志武，杨 帆，赵兴旺，倪 健，于海涛,2*

(1.佳木斯大学附属第一医院 肛肠科,黑龙江 佳木斯154002；2.佳木斯大学大肠癌研究所,黑龙江 佳木斯154002)

结直肠癌属于临床上较为常见的消化系统恶性肿瘤之一，具有较高的发病率，且发病早期具有较强的隐匿性，预后不良[1]。其中早期结直肠癌患者的5年生存率可达90%，而晚期与发生转移的结直肠癌患者5年生存率在15%以下[2]。因此，寻找一种有效的方式对结直肠癌患者进行早期诊断显得尤为重要。其中富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(Lgr5)属于Wnt/β-catenin信号通路的靶基因之一，亦是结直肠肿瘤干细胞的一种分子标志物，在结直肠癌中存在显著表达[3]。而巨噬细胞游走抑制因子(MIF)属于多生物功能细胞因子之一，在肿瘤血管生成过程中发挥着至关重要的作用[4]。迄今为止，临床上关于Lgr5和MIF在结直肠癌组织中表达的相关研究报道并不多见。本文通过研究Lgr5和MIF在结直肠癌患者中的表达及其临床意义并进行分析，旨在为临床结直肠癌患者的诊断、治疗提供新的靶点和思路，现作如下报道。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2015年9月至2017年9月我院收治的结直肠癌患者52例。其中男性患者30例，女性患者22例，年龄<60岁28例，≥60岁24例；临床分期:Ⅰ-Ⅱ期31例，Ⅲ-Ⅳ期21例；分化程度：低分化19例，中高分化33例；淋巴结转移19例；肿瘤大小：≤3 cm 15例，>3 cm 37例。纳入标准：(1)所有患者均经病理组织检查确诊为结直肠癌；(2)均符合2008年世界卫生组织(WHO)[5]制定的结直肠癌诊断标准；(3)入院前未接受任何抗肿瘤治疗；(4)具有完整的临床资料。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤或风湿免疫系统疾病者；(2)接受免疫抑制剂治疗者。52例患者均签署了知情同意书，我院伦理委员会已批准。

1.2研究方法均由手术常规留取标本，经由退水、石蜡包埋后制成组织切片。采用Evision免疫组织化学染色法对比结直肠癌组织以及癌旁组织中的Lgr5和MIF蛋白表达情况进行检测。其中Evision免疫组织化学染色法检测试剂盒与DAB酶底物显色试剂盒等一系列相关试剂均购自北京中山金桥生物技术有限公司；Lgr5和MIF抗体均购自武汉博士德生物技术有限公司。具体操作严格按照Evision免疫组织化学染色法检测试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木精复染。以已知阳性对照片为阳性对照，以PBS替代一抗为阴性对照。

1.3结果评定Lgr5和MIF蛋白表达阳性标准如下[6,7]：均着色于细胞质，呈棕黄色或棕褐色。采用双盲法由两名高年资的病理科医生对切片进行观察分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野，根据免疫组化积分法进行评估：(1)染色强度：0分即为无色；1分即为浅黄色；2分即为棕黄色；3分即为黄褐色。(2)阳性细胞占比：0分即为阴性；1分即为阳性细胞数占比≤10%；2分即为阳性细胞数在11%-50%之间；3分即为阳性细胞数占比在51%-80%之间；4分即为阳性细胞数占比>80%。将染色强度评分与阳性细胞占比评分的乘积作为最后结果，其中积分0-2分记为阴性；3-4分记为弱阳性；5-6分记为阳性；>6分记为强阳性。

1.4观察指标比较结直肠癌组织与癌旁组织中Lgr5和MIF表达情况，分析结直肠癌患者临床病理特征与Lgr5和MIF表达的关系。

1.5统计学方法本研究数据均采用SPSS20.0软件进行检测分析，采用“χ2”检验，用“[n(%)]”表示计数资料。P值<0.05表明两组数据对比具有统计学意义。

2 结果

2.1结直肠癌组织与癌旁组织中Lgr5和MIF表达情况对比

结直肠癌组织中Lgr5和MIF表达阳性率分别为65.38%(34/52)、80.77%(42/52)，均明显高于癌旁组织的34.62%(18/52)、38.46%(20/52)(均P<0.05)。见表1。

表1 结直肠癌组织与癌旁组织中Lgr5和MIF表达情况对比(例，%)

注：与癌旁组织相比，*P<0.05

2.2结直肠癌组织中Lgr5表达与临床病理特征关系分析

临床分期为Ⅰ-Ⅱ期、分化程度为中高分化、无淋巴结转移、肿瘤大小为≤3 cm结直肠癌患者组织中Lgr5阳性率分别为51.61%(16/31)、51.52%(17/33)、54.55%(18/33)、26.67%(4/15)，均明显低于临床分期为Ⅲ-Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移、肿瘤大小为>3 cm结直肠癌患者的85.71%(18/21)、89.47%(17/19)、84.21%(16/19)、81.08%(30/37)(P<0.05)。见表2。

表2 结直肠癌组织中Lgr5表达与临床病理特征关系分析(例，%)

2.3结直肠癌组织中MIF表达与临床病理特征关系分析

临床分期为Ⅰ-Ⅱ期、分化程度为中高分化、无淋巴结转移、肿瘤大小为≤3 cm结直肠癌患者组织中MIF阳性率分别为70.97%(22/31)、69.70%(23/33)、69.70%(23/33)、53.33%(8/15)，均明显低于临床分期为Ⅲ-Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移、肿瘤大小为>3 cm结直肠癌患者的95.24%(20/21)、100.00%(19/19)、100.00%(19/19)、91.89%(34/37)(均P<0.05)。见表3。

表3 结直肠癌组织中MIF表达与临床病理特征关系分析(例，%)

3 讨论

结直肠癌是全球最为常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率仅次于食管癌与胃癌[8-10]。相关研究报道显示[11,12]，随着我国人们生活水平的不断提高以及饮食习惯的逐渐改变，结直肠癌的发病率与病死率均呈逐年上升趋势[13,14]。结直肠癌的发生、进展是一种多基因、多步骤的复杂过程，因此深入研究结直肠癌的具体发病机制，对临床结直肠癌的早期诊断、指导治疗以及预后评估均有极其重要的意义。

本文结果显示：结直肠癌组织中Lgr5和MIF表达阳性率均明显高于癌旁组织。这与张书勤等人的研究报道相一致[15,16]，说明了Lgr5和MIF在结直肠癌组织中存在明显高表达，提示了在结直肠癌组织的发生、发展过程中Lgr5和MIF可能发挥着至关重要的作用。其中Lgr5在胃肠道、乳腺、大脑等多组织中均有表达，属于一种7次跨膜蛋白，其在结直肠癌发生、发展过程中的作用机制可能与其属于Wnt/β-catenin信号转导通路复合体组成之一有关，可在膜水平上提高Wnt信号通路传导效能。MIF广泛存在于机体内，属于炎症介质之一，在免疫调节中发挥着重要作用，且随着近年来相关研究的不断深入，有学者发现其在多种肿瘤组织中均呈高表达。此外，临床分期为Ⅰ-Ⅱ期、分化程度为中高分化、无淋巴结转移、肿瘤大小为≤3 cm结直肠癌患者组织中Lgr5阳性率，均明显低于临床分期为Ⅲ-Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移、肿瘤大小为>3 cm结直肠癌患者。这表明了Lgr5与结直肠癌的发生、发展、转移均存在密切相关，可作为临床上判断结直肠癌患者病情严重程度的指标。且随着Lgr5表达阳性率不断升高，患者病情不断加重，转移发生风险越高[17,18]。分析原因，Lgr5可能是通过增强结直肠癌肿瘤干细胞的自我更新能力，从而促进了肿瘤细胞的增殖以及未分化程度。因此，在临床工作中我们通过对Lgr5表达进行有效调控，可能达到治疗结直肠癌的目的，这为今后的研究提供了方向。另外，临床分期为Ⅰ-Ⅱ期、分化程度为中高分化、无淋巴结转移、肿瘤大小为≤3 cm结直肠癌患者组织中MIF阳性率均明显低于临床分期为Ⅲ-Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移、肿瘤大小为>3 cm结直肠癌患者。这提示了MIF参与了结直肠癌的发生、发展、转移等过程，且在其中发挥着至关重要的作用，可作为临床上判断结直肠癌患者病情严重程度的指标。且随着MIF表达阳性率不断升高，患者病情不断加重，转移发生风险越高[19,20]。究其原因，认为MIF可通过上调前列腺素2与环氧合酶2以及下调抑癌基因P53，从而促进新生血管的形成，促进肿瘤的生长、增殖以及侵袭；与此同时，MIF可能通过在Ras-Raf-MAPK-ERK等信号转导途径，进一步参与到结直肠癌的发生、发展过程中。

综上所述，结直肠癌组织中Lgr5和MIF蛋白均呈明显高表达，其可能与结直肠癌的发生、发展以及转移存在密切相关，通过对上述因子的表达水平进行调控，可能是临床上治疗结直肠癌的新靶点，这为我们今后的研究提供了思路。