淡紫紫孢菌对黄瓜根结线虫的防治效果

杨凡 蔡毓新 贾文华 甄熙 唐艳领 史宣杰

摘 要： 根结线虫（Meloidogyne spp.）是一類严重危害经济农作物并广泛分布于世界各地的重要的植物病原线虫。淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）能够寄生于根结线虫和孢囊线虫卵，对根结线虫有很强的抑制作用。为了检验淡紫紫孢菌对黄瓜根结线虫的防治作用，测定了淡紫紫孢菌pt361对黄瓜根结线虫卵的寄生率、幼虫致死率，并分析了淡紫紫孢菌的代谢产物白灰制菌素，同时测定了其在土壤中的存活状态。结果表明，淡紫紫孢菌pt361菌株对线虫卵寄生率为72.6%。其菌株混合发酵液对黄瓜根结线虫幼虫致死率达95.2%。对pt361菌株代谢产物进行检测，发现有白灰制菌素A和B，其浓度分别为98.9%和71.2%，这可能与淡紫紫孢菌防治根结线虫的机制有关。综上所述，淡紫紫孢菌能有效防治黄瓜根结线虫。

关键词： 黄瓜； 淡紫紫孢菌； 根结线虫； 白灰制菌素

Abstract： Root knot nematode is a kind of important plant disease nematode， which distributes widely and causes serious harm to crop production in the world. The Purpureocillium lilacinum can inhibit root knot nematode according to parasitic on the root knot nematodes and sporangium. In order to investigate the preventive effect of Purpureocillium lilacinum on cucumber root knot nematode， the parasitic rate and larvae of mortality when the Purpureocillium lilacinum pt361 interacted with the cucumber root knot nematodes were measured， the metabolites of leucinostatins was analyzed， and the survival state of pt361 strains in soil was determined. The results showed that the parasitism rate of pt361 strains on cucumber root knot nematodes was 72.6%， and the larva fatality rate of its mixed fermentation broth could reach 95.2% on the cucumber rootworm. It was found that the concentrations of leucinostatins A and B were respectively 98.9% and 71.2% when the metabolites of pt361 strains were detected， which might be related to the prevention mechanism to control the root knot nematodes. In conclusion， the Purpureocillium lilacinum could effectively control the root nematode of cucumber.

Key words： Cucumber； Purpureocillium lilacinum； Root knot nematode； Leucinostatins

根结线虫（Meloidogyne spp.）是一种较为严重的土传病害，全世界由根结线虫造成的农作物损失高达10亿美元[1-2]。黄瓜是最易受到根结线虫侵染的作物之一，严重时可减产30%～40%，甚至绝收[3]。生产上防治根结线虫主要有使用化学杀线剂、利用抗病品种以及生物防治等方式。化学防治虽然见效快，但有高毒性，污染环境。培育抗根结线虫作物被认为是经济、安全、高效的方法，目前在番茄上的抗根结线虫基因Mi 1.2已被商业化生产[4]，但在黄瓜上的抗根结线虫基因尚未被发现[5-6]。生物防治根结线虫日益受到重视，是未来的趋势之一。目前生物防治黄瓜根结线虫的方法主要集中在线虫天敌和杀线虫植物提取液的研究上[7]，常见的有食线虫真菌包括寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）、淡紫紫孢菌（Paecilomyces lilacinus）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）等寄生细菌以及放线菌中的一些种类。选择合适的生防菌株防治黄瓜根结线虫对农业的可持续发展有重要意义[8]。

淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）能够有效防治根结线虫、穿孔线虫、胞囊线虫、肾形线虫等，是一种极具推广潜力的防治根结线虫的习居菌和功能菌[9-10]。淡紫紫孢菌能破坏根结线虫的虫卵结构，同化虫卵物质，使线虫不能正常孵化。笔者在对淡紫紫孢菌致病力研究时，筛选出了一株对根结线虫有致病力菌株pt361。笔者测定了淡紫紫孢菌pt361对黄瓜根结线虫卵的寄生率以及对线虫的致死力，并在菌株pt361的发酵液中检测出了白灰制菌素A和B，其是白灰制菌素家族的重要组成成分，白灰制菌素A对线虫有致死作用。同时对淡紫紫孢菌在土壤中的存活作了初步分析，以便为淡紫紫孢菌生防菌株的应用提供科学依据和技术指导。

1 材料和方法

1.1 菌株及培养方法

淡紫紫孢菌pt361，原始菌株pl36-1 T-DNA插入突变获得稳定的突变子。28 ℃ PDA平板培养，4 ℃试管保存。

1.2 培养基配方

PDA培养基：土豆提取液200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，高温灭菌30 min。

PDB培养基：土豆200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL。

WA培养基：水1 000 mL，琼脂18 g。

培养基B：50.0 g葡萄糖，5.0 g蛋白胨，5 g酵母提取物，1.0 g K2HPO4，10.0 g Na2CO3，0.2 g MgSO4·7H2O，加水定容至1 000 mL灭菌。

土壤分离培养基OHIO-agar：5 g葡萄糖，2 g酵母提取物，1 g NaNO3，0.5 g MgSO4·7 H2O，1 g KH2PO4，1 g牛胆粉，1 g丙酸钠，18 g琼脂，1 000 mL水。培养基中加入多菌灵，使培养基中药剂最终质量浓度为30.0 μg·mL-1。

1.3 淡紫紫孢菌pt361对根结线虫卵的寄生率测定

2017年3月在河南省农业科学院植物病理实验室用1%次氯酸钠溶液将黄瓜植株有根结线虫病害的病根浸泡并震荡4 min，清洗并过筛后收集根结线虫虫卵。处理组将淡紫紫孢菌pt361培养3 d后，将线虫卵至于菌丝上方，每皿100个线虫卵，3个皿1重复，共3次重复。28 ℃温箱黑暗培养9 d。对照线虫虫卵不作任何处理。之后用乳酸甘油溶液处理2 min，会发现透明的卵是被淡紫紫孢菌寄生的，未被寄生的卵仍为深色。寄生率/%=被寄生的卵的数量/总调查卵的数量。

1.4 淡紫紫孢菌pt361对根结线虫幼虫致死率测定

配置淡紫紫孢菌无菌发酵液0.5 mL；将从黄瓜根结上面分离到的线虫制成0.5 mL的线虫液（100条·mL-1），然后将二者混合均匀并置于28 ℃培养箱中培养，对照组的线虫液加入等量的清水处理。每个处理3次重复。24 h后计算幼虫死亡率。死亡率=（Ca-Ta）/Ca，Ca代表对照中未死亡的线虫数量，Ta代表处理中未死亡的线虫数量。

1.5 淡紫紫孢菌pt361菌株代謝产物白灰制菌素的提取及测定

白灰制菌素提取方法如下[11]：将培养9 d的pt361菌株制成106孢子·mL-1孢子悬浮液，取1 mL放入100 mL培养基B的锥形瓶中28 ℃、200 r·min-1培养15 d。将1 mol·L-1 HCl溶液也加入到锥形瓶中，调节pH值到3.0，然后加入同体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取液用5% NaHCO3溶液，将萃取液洗涤2次，真空旋转干燥。然后用10 mL的甲醇溶液对粗提物即白灰制菌素进行溶解，再用质谱仪（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry MALDI-TOF MS）进行物质分析和浓度测定。

1.6 淡紫紫孢菌pt361菌株在土壤中的存活测定

将淡紫紫孢菌pt361菌株制成孢子液和固体发酵物2种形式，然后拌入土壤，使淡紫紫孢菌的浓度为106个·g-1。再将其装入塑料杯（直径7 cm，深8 cm）中，每杯装土壤（黄壤土）基质（V土︰V沙=1︰1）200 g，然后将其埋于田间土壤中（河南省新乡市原阳县河南现代农业研究开发基地）。每间隔10 d取出塑料杯，测定淡紫紫孢菌pt361在土壤中的定殖量，持续测定60 d。测定时间自2017年5—7月。设未接种做对照。

1.7 检测方法

将塑料杯中的土壤混匀后分别称取10 g 2份，一份放入烘箱中80 ℃12 h测质量；一份用于分离淡紫紫孢菌。每次取3杯即为3次重复。将菌液均匀涂于平板上，放入恒温箱中，28 ℃培养5 d后，计数平板菌落。

1.8 数据统计与分析

数据分析使用SPSS 12.0.1，数据表示平均值±SD标准差（mean±SD）。用Duncan's Multiple测试进行多组分比较，确定组间差异显著。P<0.05被认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 淡紫紫孢菌pt361对根结线虫卵寄生率的测定

淡紫紫孢菌pt361对根结线虫卵的寄生率测定结果表明pt361菌株对线虫卵寄生率为72.6%。具体结果见图1和表1。

2.2 淡紫紫孢菌pt361对根结线虫幼虫致死率的测定

淡紫紫孢菌株对根结线虫幼虫致死率测定表明，菌株混合发酵液对黄瓜根结线虫幼虫致死率达95.2%；pt361菌株对线虫幼虫致死率为3.6%。说明淡紫紫孢菌代谢产物对根结线虫幼虫有强致死作用（表2）。

2.3 淡紫紫孢菌pt361中白灰制菌素的测定

通过提取淡紫紫孢菌pt361白灰制菌素发现，原始菌株pt361中白灰制菌素A和B以一定的比例存在，可以用来作为检测线虫活性的重要指标。本试验测得白灰制菌素A和B的质量分数分别为98.9%和71.2%（表3）。

2.4 淡紫紫孢菌pt361菌株在土壤中的存活动态

分别以固体发酵物和孢子液2种形式将pt361菌株施入土壤中，从图3可以看出，随着时间的延长菌株的定殖量有所降低。固体发酵物总体比孢子液的存活量高，60 d后2种形式的菌株存活量还保持在105、104数量级，因此，固体发酵物更有利于pt361菌株在土壤中的长期存活。

3 讨论与结论

综合开发能防治根结线虫的菌剂是未来的研究热点之一，已报道的丛枝菌根真菌能够对西瓜嫁接苗抗南方根结线虫，提高西瓜的生长指标和生理特性[12]，其也能与黄瓜建立共生体，防御黄瓜根结线虫[13]；芽孢杆菌发酵的上清液处理黄瓜根结线虫时，也能收到较好的效果[14]。淡紫紫孢菌是一种分布广泛的线虫卵寄生真菌[15]，是植物寄生线虫的重要天敌，在杀线虫时具有安全、高效、持效时间长的特点，其对线虫的最重要的作用机制是寄生卵，寄生后使线虫卵壳发生了一系列的化学变化，最终影响线虫的正常发育而导致死亡[16]。

pt361菌株对黄瓜根结线虫寄生率的研究结果表明，pt361菌株可以侵染根结线虫的卵，寄生率达到72.6%；pt361菌株混合发酵液对线虫的致死率达到95.2%，在试验条件下，能有效防治根结线虫。为了最大限度发挥淡紫紫孢菌的抗线虫优势，本试验制定了2种形式的菌剂-固体发酵物和孢子液，发现固体发酵物能显著提高pt361菌株在土壤中的存活率，可能是这种形式能给菌株提供固着的介质，使淡紫紫孢菌能稳定定殖在土壤中发挥生防效力。试验结果也表明，淡紫紫孢菌pt361以固体发酵物可以在土壤中存活60 d以上，且能一直维持较高的定殖量，这有利于淡紫紫孢菌在整个作物的生育期持续的防治土传病害。

进一步对根结线虫的发酵液进行分析，发现了白灰制菌素A和B，白灰制菌素A在致死幼虫方面有重要的作用，可以作为检测线虫的重要指标，可望在将来更深层了解淡紫紫孢菌对线虫的致病机理及利用这一特点开发新的复合制剂用于防控根结线虫，有利于淡紫紫孢菌在生产上推广应用[17]。

参考文献

[1] ESCOBAR C，BARCALA M，CABRERA J，et al.Overview of root-knot nematodes and giant cells[J].Advances in Botanical Research，2015，73：1-24.

[2] WESEMAEL W M L，VIAENE N，MOENS M.Root-knot nematodes （Meloidogyne spp.） in Europe[J].Nematology，2011，13（1）：3-16.

[3] 顾兴芳，张圣平，张思远，等. 抗南方根结线虫黄瓜砧木的筛选[J].中国蔬菜，2006（2）：4-8.

[4] TZORTZAKAKIS E A，ADAM M A，BLOCK V C，et al.Occurrence of resistance-breaking populations of root knot nematodes on tomato in Greece[J].European Journal of Plant Pathology，2005，113（1）：101-105.

[5] SK?LOV? D，NAVR?TILOV? B，LEBEDA A.Embryo rescue of cucumber （Cucumis sativus），muskmelon （C.melo） and some wild Cucumis species （C.anguria，C.zeyheri，and C.metuliferus）[J].Journal of Applied Botany and Food Quality，2008，82（1）： 83-89.

[6] WALTERS S A，WEHNER T C.Incompatibility in diploid and tetraploid crosses of Cucumis sativus and Cucumis metuliferus[J].Euphytica，2002，128（3）：371-374.

[7] 鄢小寧.利用黄瓜幼苗内生真菌种子处理防治南方根结线虫的研究[D].杭州：浙江大学，2010.

[8] 马玉琴，魏偲，茆振川，等，生防型菌肥对黄瓜生长及根结线虫病的影响[J].中国农业科学，2016，49（15）：2945-2954.

[9] ATKINS S D，HIDALGO-DIAZ L，KALISZ H，et al.Development of a new management strategy for the control of root-knot nematodes （Meloidogyne spp.） in organic vegetable production [J].Pest Management Science，2003，59（2）：183-189.

[10] ZHANG S，GAN Y，Xu B.Biocontrol potential of a native species of Trichoderma longibrachiatum against Meloidogyne incognita[J].Applied Soil Ecology，2015，94：21-29.

[11] YUZURU M，KATSUKIYO Y，KAZUTAKA F.Paecilotoxin production in clinical or terrestrial isolates of Paecilomyces lilacinum strains[J].Mycopathologia 1989，108（3）：195-199.

[12] 吕星光，刘润进，李敏.丛枝菌根真菌对西瓜嫁接苗抗南方根结线虫病的影响[J].菌物学报，2017，36（7）：1018-1027.

[13] 张淑彬，王幼珊，邹国元.丛枝菌根真菌对黄瓜南方根结线虫病害防治效应[J].北方园艺，2011（19）：123-126.

[14] 孙尹双.芽孢杆菌AMCC100150防治黄瓜根结线虫病及发酵条件优化[D].山东泰安：山东农业大学，2016.

[15] 肖顺，张绍升.根结线虫的寄生菌物生物多样性[J].福建农林大学学报（自然科学版），2004，33（4）：434-437.

[16] 刘晓莉，淡紫拟青霉对南方根结线虫侵染机制的研究[D].合肥：安徽农业大学，2011.

[17] 成儒萍，肖炎农，黄永兵，等.耐多菌灵淡紫拟青霉对线虫的致病力及其在土壤中的存活[J].中国生物防治，2010，26（1） ：80-84.