基于高通量测序技术的溃疡性结肠炎大肠湿热证患者肠道菌群多样性的研究＊

丁庞华，李军祥，郭 一，毛堂友，赵兴杰＊＊

（1.北京中医药大学东方医院 北京 100078；2.北京中医药大学 北京 100029）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因尚未明确，病变呈连续性，可累及直肠、结肠的黏膜层及黏膜下层的慢性非特异性炎症性疾病[1]，主要影响15-40岁的中青年人。UC属于终身疾病，临床上以腹痛、腹泻、黏液脓血便等为主要表现，其病程反复迁延不愈，以发作、缓解和复发交替为特点，严重影响患者的生活质量，因此被世界卫生组织列为现代难治病之一，也是目前消化领域的研究热点。随着近年来生活水平的提高、饮食结构、生活习惯的改变、环境的变化，以及诊断技术的不断进步，UC的发病率和患病率也呈现出逐年升高的趋势，我国目前的UC患病率约为11.6/10万[2]。UC病程迁延不愈，复发率高，UC的严重并发症—溃疡性结肠炎相关性结直肠癌占UC患者死亡原因的9%-11%[3]。

目前，UC的病因尚不清楚，研究者普遍认为UC的发病与宿主共生的肠道菌群紊乱，免疫功能失调，氧化应激以及炎症介质的参与等有关[4]。尽管UC发病机制仍不清楚，但肠道内固有菌群的分布与UC的关系是近年的研究热点。研究者普遍认为UC的发病与宿主共生的肠道菌群紊乱有着密切的关系，认为肠道内菌群是UC发病过程中的启动和促进因素，在UC的发病机制中起着至关重要的作用[5]。而大肠湿热证作为活动期UC的最主要证型[6]，其生物学内涵具有重要的研究价值，因此本课题组选取活动期大肠湿热证的溃疡性结肠炎患者与健康人群的粪便作为标本，用16S rRNA二代测序的方法检测标本的菌群丰度及多样性，从而比较健康人群与大肠湿热证的溃疡性结肠炎患者之间肠道菌群的差异，以探讨肠道菌群在溃疡性结肠炎大肠湿热证患者发病过程中的可能存在的作用。

1 资料与方法

1.1 病例选择

1.1.1 西医诊断标准

按照中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2012年·广州）》的诊断标准［7］。

1.1.2 中医辨证标准

参照2017年中华中医药学会脾胃病分会制订的《溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见》［8］。大肠湿热证诊断标准如下：主症：（1）腹泻黏液脓血便（2）腹痛（3）里急后重；次症：（1）肛门灼热（2）身热不扬；（3）口干口苦（4）小便短赤；舌脉：舌质红苔黄腻；脉滑数。

证型确定:具备主症2项（第1、2项必备）加次症1项，参考舌脉即可诊断。

1.1.3 纳入标准

（1）符合UC活动期标准的初发型或慢性复发型患者；（2）根据改良Truelove和Witts疾病严重程度分型标准，病情属于轻中度UC；（3）中医辨证属大肠湿热者；（4）年龄18-65岁；（5）自愿参加并签署知情同意书者。

过去一年于朦胧是这样度过的：用330天的时间在剧组里演戏，用不在剧组的时间录制完整张音乐新专辑。工作日夜轮转无休，于朦胧反而对工作越来越生出眷恋之心，剧组在哪儿，心就定在哪儿。

1.1.4 排除标准

（1）有严重并发症，如局部狭窄、肠梗阻、肠穿孔、中毒性巨结肠、直肠癌、结肠癌及肛门疾病者；（2）妊娠或正准备妊娠的妇女及哺乳期妇女；（3）过敏体质及对多种药物过敏者；（4）合并肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重原发性疾病及精神病患者；（5）仍在进行其他溃疡性结肠炎治疗方案的患者；（6）3个月内参加其他临床研究项目的患者近。

1.2 临床资料

患者为北京中医药大学东方医院脾胃肝胆科2017-07/2017-12就诊为UC的患者；本研究共包括28名志愿者，其中14例溃疡性结肠炎（UC）随机选择同期健康人群14例作为对照组，病例组男性6例、女性8例；对照组男性6例、女性8例。由于抗生素对肠道菌群影响较大，要求所有病例在采样前均未接受过任何抗生素治疗，正常对照者3月内未发生过消化系统疾病,也未使用过抗生素，根据纳入标准进行筛选。所有参与实验者均已签署实验知情同意书，且该项目通过北京中医药大学东方医院伦理委员会的批准。

1.3 研究方法

1.3.1 粪便样本DNA提取、文库构建及测序

DNA提取：高通量测序对DNA的完整性有较为严格的要求。采用粪便DNA提取试剂盒提取粪便组织中DNA，通过Qubit对DNA浓度进行定量，并通过Agilent 2100对DNA完整性进行评价。对DNA质量达到要求的样本进行文库构建。

文库构建：采用独特的二步PCR方法进行样本文库构建。以不同样本DNA为模板，通过PCR反应完成第一轮扩增。采用磁珠法对PCR产物进行纯化后，分别用含有不同index的引物（该引物含有与测序flow cell上面接头配对的序列、区分不同样本之间的index序列及悬挂接头序列的一部分）进行第二轮PCR扩增，再经磁珠纯化后，分别用Qubit和Agilent2100对文库的质量进行检测。检测合格的文库将采用Illumina Hiseq2500高通量测序平台对样品进行测序。

本项目采用Illumina公司的HiSeq2500测序仪进行高通量测序。该测序平台可以针对16S rRNA的一个或多个高变区域进行测序，样本制备文库的DNA起始量可低至50 ng。文库制备完成后，簇生成和测序都在HiSeq2500上完成。

1.3.2 测序结果的生物信息学分析

对测序结果根据不同的标签序列区分不同的样品相关序列并建立相应文库，用CD-HIT软件进行聚类分析，并进一步完成各文库中可操作分类单位（operational taxonomic units，OTUs）分析。依托新一代DNA测序仪和计算平台，经过宏基因组分析技术得到肠道菌群分布。

2 结果

2.1 PCA分析及PLS-DA分析

PCA分析（图1A）和PLS-DA（图1B）显示两组之间存在显著差异，Adonis/PERMANOVA多元方差分析和置换检验以及Anosim相似度分析均表明溃疡性结肠炎大肠湿热证患者与健康人群之间有显著性差异，P值分别为0.008和0.002（图1）。

图1 A：PCA分析，B：PLS-DA分析（Clotis：溃疡性结肠炎组；Healthy：健康人群组）

2.2 门水平分析

结果显示，溃疡性结肠炎大肠湿热证患者与健康人肠道菌群的差异（图2）：其中，大肠湿热证溃疡性结肠炎患者的拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）的细菌均低于健康人，但是变性菌门（Proteobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）的比例高于健康人；图3结果示：Alpha多样性分析：溃疡性结肠炎大肠湿热证患者的多样性均高于健康人肠道样本。

2.3 溃疡性结肠炎

大肠湿热证患者与健康人群的LDA结果，溃疡性结肠炎大肠湿热证患者与健康人群肠道菌群的丰度之间存在显著的差异，其中健康人群中以类杆菌科（Bacteroidaceae）、多形杆状菌（Bacteroides）、硬壁菌门（Firmicutes）、梭菌属（Clostridia）等为主；溃疡性结肠炎大肠湿热证患者以乳杆菌属（Lactobacillus）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、Erysipelotrichaceae、Erysipelotrichales等为主。以上结果均证实溃疡性结肠炎大肠湿热证患者与健康人群之间的肠道菌群的整体结构确实存在着显著的差异（图4）。

3 讨论

溃疡性结肠炎的发病是一个涉及多因素、多环节共同作用的过程，其中包括遗传、环境、感染、免疫等多种因素[9]。尽管发病机制尚不明确，多数学者认为环境和遗传因素、肠道微生态失调、适应性免疫失常和（或）有缺陷的细胞自噬与其发生发展有关，并提出UC的本质可概括为遗传易感人群中被异常放大的肠道黏膜免疫反应[10]。

图2 门水平上溃疡性结肠炎患者与健康人肠道细菌差异（Clotis：溃疡性结肠炎组；Healthy：健康人群组）

溃疡性结肠炎是由易感基因、粘膜免疫和肠道微生态等多重因素共同作用所导致的疾病，其具体的发病机制尚待进一步完善与发现，而肠道微生态在其中发挥着极其关键的作用。越来越多的研究发现UC中肠道菌群失调，并表现在菌群多样性的下降以及丰度的改变，且失衡的肠道菌群与UC的疾病活动度有着一定的联系。NEMOTO等［11］收集了48例溃疡性结肠炎患者的粪便，结果发现溃疡性结肠炎患者粪便肠道菌群的多样性明显降低。其中，类杆菌和梭状芽孢杆菌显著减少，而肠球菌的数量明显高于健康受试者。王艳等［12］将收治的401例溃疡性结肠炎患者进行Mayo评分并分期对比，分析其菌群失调度和免疫球蛋白水平发现，疾病活动度与菌群失调程度呈正相关，随着病情加重，患者的免疫力也逐渐下降。

图3 溃疡性结肠炎患者与健康人样本的Alpha多样性分析（Clotis：溃疡性结肠炎组；Healthy：健康人群组）

在肠道内环境维持稳定方面，肠道菌群起到不可或缺的作用；正常的肠道菌群在肠道的防御、物质的合成以及代谢、生长和衰老等诸多方面都起到重要的作用。当肠道菌群发生比例的失调、某些菌株的定位转移时，肠道疾病就会明显加重，人体衰老的进程加速，甚至会发生癌变。有研究发现，肠道菌群的失调可能是UC发生、发展的始动环节［13］。UC患者中菌群的结构出现严重失衡，如大肠杆菌、假单胞菌属、沙门菌、空肠弯曲菌、艰难梭菌、瘤胃球菌属、肠杆菌科、变形菌门、放线菌门等普遍增高;柔嫩梭菌、厚壁菌门、梭菌群Ⅳ、拟杆菌门等均减少[14]。当肠道炎症发生时，肠道菌群的失衡能够破坏共生菌群与宿主免疫系统之间的动态平衡，诱发肠道产生免疫反应，导致溃疡性结肠炎的发生[15,16]。当宿主的肠道菌群发生紊乱时，肠道内大量的致病菌繁殖，破坏了肠道固有的粘膜屏障，同时因为肠道致病菌的侵入，肠道通透性也进一步的被扩大，进而使得大量的细菌及其代谢产物透过固有的黏膜屏障进入到机体，从而影响到肠道的免疫功能，最终导致UC的发生［17］。

有研究认为溃疡性结肠炎不同中医证候之间肠道菌群的数量以及丰度存在一定的差异。陈韵如研究发现，相较于溃疡性结肠炎脾气虚证的患者，脾胃湿热证患者的粪便中双歧杆菌高于前者；而与健康人群相比，脾胃湿热证患者的粪便中双歧杆菌、大肠杆菌含量与健康人群无明显差异[18]。李舒通过16S rRNA高通量测序技术对溃疡性结肠炎湿热内蕴、脾胃气虚、脾虚胃热单重证型的肠道菌群16S V3-V4区进行测序发现：与健康人群组相比，湿热内蕴和脾虚湿热患者厚壁菌门比例较低，以韦荣球菌较为突出。脾虚湿热患者肠道内的变形杆菌门高于脾胃气虚患者，而变形杆菌门中的嗜血杆菌中，湿热内蕴组所占比例均高于另外2个证候。拟杆菌在湿热内蕴组中高于健康人组。普氏菌在3组证候中均低于健康人。棒状杆菌在湿热内蕴患者中高于脾胃气虚。真杆菌属在脾胃气虚组和脾虚湿热组中低于健康人组[19]。

结合临床中UC的表现，湿热是UC的重要病理因素，刘河间在《原病式》中就指出“诸泻痢皆属于湿，湿热甚于肠胃之内，而肠胃怫郁，以致气液不得宣通而成”。根据UC活动期患者腹痛、腹泻和黏液脓血便这一最大特点，中医多将该病归属于“肠澼”或“久痢”的范畴，其中大肠湿热证的病因病机复杂多样，外感湿热之邪，或饮食不节，脾胃受伤；或情志不畅，恼怒伤肝，肝气犯脾；或郁思伤脾，日久导致脾胃虚弱，运化失司，水湿内停，湿郁化热，湿热内蕴，湿热与肠道气血相搏结，气血凝滞，化为脓血，从而导致发病。根据最新的有关溃疡性结肠炎各时期证型的聚类分析结果显示，大肠湿热证占所有类型的34.8%，活动期的大肠湿热证所占的比例可高达48%[6]。且研究认为溃疡性结肠炎不同中医证候之间肠道菌群的数量以及丰度存在一定的差异[15,16]。因此，大肠湿热证作为UC活动期最基本的中医证型，从肠道微生态角度探索其生物学内涵具有重要的临床价值与现实意义。

本次研究通过宏基因组学16S rRNA测序技术分析溃疡性结肠炎大肠湿热证患者与健康人群的菌群构成。在研究中通过PCA分析和PLS-DA发现大肠湿热证溃疡性结肠炎患者与健康人之间肠道菌群存在明显差异；在门水平上两组之间的肠道菌群存在显著差异；通过Alpha多样性分析发现大肠湿热证溃疡性结肠炎患者的肠道菌群的多样性高于健康人群；以及LDA结果显示大肠湿热证溃疡性结肠炎患者与健康人群肠道菌群的丰度之间存在显著差异。且研究中发现Akkermansia菌在溃疡性结肠炎患者中处于富集状态，结合其以往的报道显示与肥胖和炎症呈负相关，因此我们大胆提出Akkermansia可能是一种可以破坏肠道粘膜的细菌，在有溃疡存在的时候更适应其生长与繁殖，属于大肠湿热证溃疡性结肠炎的特异菌种，可能在大肠湿热证溃疡性结肠炎的发病过程中起到关键性作用，为下一步研究大肠湿热证溃疡性结肠炎相关菌群以及大肠湿热证溃疡性结肠炎的相关微生物学机制提供一定的基础。

本研究作为初步探索性研究，结果提示溃疡性结肠炎大肠湿热证患者的肠道菌群较正常人有一定差异。有学者研究发现溃疡性结肠炎肠道菌群的分布与中医的辨证分型之间存在着一定的联系[18,19]。这为我们进一步挖掘肠道菌群与溃疡性结肠炎大肠湿热证之间的相关性，并通过肠道菌群揭示大肠湿热证的生物学内涵提供了重要的前期基础。本次研究中发现了溃疡性结肠炎大肠湿热证患者与正常人之间肠道菌群的差异，其中某些菌群的特异性的增加或减少导致了肠道菌群的失衡，可能破坏了人体免疫平衡；这为我们进一步研究溃疡性结肠炎肠道病变的发生发展提供了可能的方向。且本研究所揭示的与UC相关的菌群结构变化特征也将有助于更深入地研究宿主和肠道菌群之间在代谢和免疫等方面的相互作用，并揭示菌群在UC发生发展过程中的作用。本研究运用当前高通量测序技术发现了溃疡性结肠炎大肠湿热证患者肠道菌群的特异性，其中某些菌群的改变在今后的进一步的研究中，可作为评价溃疡性结肠炎大肠湿热证患者的参考指标，定期检测某些菌群丰度的改变有助于判断肠道菌群的恢复情况，对治疗效果的评判有重要的临床价值。

图4 溃疡性结肠炎大肠湿热证患者与健康人群的LDA结果（Clotis：溃疡性结肠炎组；Healthy：健康人群组）

虽然本次研究能够观察到大肠湿热证的溃疡性结肠炎患者于正常人之间的肠道菌群之间存在着菌群结构的失调、肠道菌群的结构也发生了相应的改变；但因为本次研究作为初步探索性的研究，样本量较低可能是导致本次研究与之前其他学者的研究存在一定的差异的原因。因此在今后的研究过程中，我们会进一步的加大样本量，进行更加详细的观察与研究；通过高通量测序方法进一步研究溃疡性结肠炎不同证候之间肠道菌群的差异，分析在前期实验过程中存在的特异性菌群在大肠湿热证溃疡性结直肠炎中富集的真正原因以及其他相关菌群可能存在的潜在变化，为阐明UC大肠湿热证的本质提供微生态学依据并对临床治疗溃疡性结肠炎提供依据。