妊娠对肺动脉高压肺循环影响的实验研究

李 月 金 沐 景 赫 孙雨薇 程卫平

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是指静息状态下经肺动脉导管测量平均肺动脉压≥25mmHg(1mmHg=0.133kPa)的病理状态[1]。妊娠因其血流动力学变化加重心肺循环负担，可以导致肺动脉高压[2]，被认为是PAH禁忌[3-4]。我们前期发现，妊娠合并肺动脉高压患者中96.7%的患者合并有先心病[5]，而国外报道中，64%为合并特发性肺动脉高压(idiopathic PAH，IPAH)[6]。我们同时发现，无论类型是否相同，大多数产妇死亡事件都发生在分娩后的第一个月内[12]。为此，建立妊娠合并肺动脉高压的动物模型、探寻产后PAH患者死亡的原因，具有明显临床意义和研究价值。

本实验计划在MCT诱导PAH大鼠模型的基础上建立妊娠合并PAH大鼠模型。并通过此模型，观察妊娠对PAH大鼠肺循环的影响，探索影响终止妊娠后PAH产妇发生严重心脏不良事件的原因。

材料与方法

1.实验动物及分组 本实验使用雌性,SD大鼠，依照首都医科大学附属北京安贞医院实验动物饲养与使用指南，饲养于北京安贞医院实验动物饲养中心(SYXK(京)2016-0027)。所有大鼠提供充足的食物和水源，饲养环境为24h的亮暗光照循环，空气湿度50%～60%，温度20～22oC。

将大鼠随机分为四组：①空白对照组(n=15)，②野百合碱(MCT)组(n=20)，③妊娠组(n=16)，④妊娠MCT组(n=20)。四组大鼠均每周称重1次，称重同时按“活跃”、“一般”及“不活跃”记录一般状态。

2.肺高压模型的建立 经过1周适应性饲养之后(即7周龄)，MCT及妊娠MCT组大鼠通过颈背部单次皮下注射配制好的MCT(Sigma-Aldrich, 美国；剂量：60 mg/kg)的方法来诱导PAH。对照组及妊娠组给予相同容量的0.9%氯化钠溶液。

3.妊娠模型的建立 在大鼠9周龄时，妊娠及妊娠合MCT组大鼠开始进行合笼(雌雄共养)。按照雄∶雌=1∶2～3的比例进行合笼，时间从每天20:00到次日8:00。每天早上结束合笼时检查雌鼠的阴栓，若可见阴栓即认为合笼成功，否则继续合笼。为控制合笼成功时间差距过大导致的实验误差，将合笼不成功大鼠继续合笼时长限制在1周之内。

4.血流动力学测量 在记录成功合笼时间的18d后，即达到大鼠的妊娠晚期，进行血流动力学指标测量。合笼前对照组及MCT组中体重(相差≤5g)及一般状态与妊娠组及妊娠MCT组相近的大鼠，在同一天采集指标。首先使用3%戊巴比妥钠(2～3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，按7mL/kg的潮气量，50次/min的呼吸频率，和2.5cmH2O(1 cmH2O=0.098kPa)的呼末压力进行机械通气[18](呼吸机：奥尔科特ALC-V8，上海)。经右侧股动脉置管(BD Insyte-W 24G, 美国)实时监测体循环压力(SAP)变化；开胸后经右心室置管于肺动脉主干，实时监测肺动脉压力(PAP)变化(压力换能器：Edwards PX260，美国；监护仪：Hewlett M1 166A，美国)。

5.肺动脉形态学测量 结束血流动力学测量后，麻醉状态下处死大鼠。留取大鼠右肺中下叶固定于4%多聚甲醛溶液，经石蜡包埋及HE染色(染色液：中杉金桥ZLI-9615，北京)，制成5μm厚切片。每只大鼠光镜(尼康Eclipse 90i, 日本)下观察10～12个直径50～200mm的肺中小动脉，通过计算相对中膜厚度评估肺血管重塑程度(照相：尼康DS-Ri1-U3，日本；测量：Image Pro Plus 6.0, 美国)。相对中膜厚度由以下公式求得：(ED-ID)/ED x 100% (ED, 外径; ID, 内径)[19]。另外统计平均每只大鼠10个低倍镜视野下的肺血管密度(个/mm2)，并分别统计增厚肺小血管密度，非增厚肺小血管密度及阻塞肺小血管密度。

6.统计学方法 实验数据均通过SPSS 22.0统计分析。经正态性及方差齐性检验后，符合正态分布及方差齐的计量资料以均数±标准差表达, 采用方差分析，两两比较采用SNK 法检验; 不符合正态分布数据以中位数(四分位数间距)表达，采用秩和检验。计数资料以频数(率)表示,采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

在注射MCT后、进行血流动力学测量前，MCT组共死亡8只大鼠，妊娠MCT组共死亡6只大鼠。而妊娠组有4只未合笼成功，妊娠MCT组未死亡大鼠中有2只未合笼成功。最终，各组大鼠例数分别为：①空白对照组(n=15)，②MCT组(n=12)，③妊娠组(n=12)，④妊娠MCT组(n=12)。

1.MCT增加大鼠肺循环压力 空白对照组与MCT组PAP比较 [(19.33±5.39)vs. (33.5±5.49)mmHg，P<0.001]显著降低，PAP/SAP[37.31(27.73，42.71)vs.77.82(53.33，100)%，P<0.001]也呈同一趋势, SAP [(53.93±10.91)vs. (44.17±16.75)mmHg，P=0.079] 差异无统计学意义。与妊娠组PAP [(19.33±5.39)vs.(19.42±2.61)mmHg]；PAP/SAP [37.31(27.73，42.71)vs. 34.59(33.33，36.96)%]，及SAP比较,差异无统计学意义。与妊娠MCT组 PAP[(19.33±5.39)vs.(26.25±5.53)mmHg,P=0.001]及PAP/SAP比较[37.31(27.73，42.71)vs.54.65(36.84，71.11)%，P=0.013]均显著降低; SAP [(55.75±11.30)vs. (50.83±18.32)mmHg，P=0.435] 差异无统计学意义(图1)。

图1 各组大鼠PAP及SAP水平注：与空白对照组相比，aP<0.001；妊娠MCT组vs.妊娠组，bP<0.01；MCT组vs.妊 娠MCT组，bP<0.01

2. MCT损伤大鼠肺血管基本形态 (1)与空白对照组及妊娠组对比，MCT组及妊娠MCT组大鼠的肺组织切片显示，肺小动脉内膜明显增生，可见微血管瘤形成及小血管阻塞。光镜下可见此两组大鼠的肺动脉管壁平滑肌层明显增厚，管腔缩小(图2)。

(2)大鼠肺小动脉相对中膜厚度 四组大鼠相对中膜厚度的比较可见: MCT组大鼠较空白对照组 [(38.00±11.56)vs. (23.87±3.78)%，P<0.001] 相对中膜厚度明显增厚; 妊娠MCT组大鼠较妊娠组 [(34.83±6.37)vs. (29.08±4.66)%，P=0.019] 相对中膜厚度明显增厚(图3)。

(3)大鼠的肺小动脉密度 各组大鼠的肺小动脉密度分析结果显示:MCT组及妊娠MCT组大鼠总肺小动脉密度、增厚肺小动脉密度及闭塞肺小动脉密度的增加,差异均有统计学意义(P<0.05)，而未增厚肺小动脉密度明显小于其他两组 (P<0.05,表1)。四组不同程度中膜厚度肺小动脉数量占总肺小动脉数量的比例的结果, 进一步验证了表1结论。MCT组及妊娠MCT组大鼠增厚及闭塞肺小动脉密度的比例也明显高于另外两组(表2)。

表1 各组大鼠肺小动脉密度 个/mm2)

注：MCT组与对照组比较,aP<0.001，P<0.05; 妊娠MCT组与妊娠组比较，aP<0.001；妊娠MCT组与MCT组比较，bP<0.01

图3 四组间肺小动脉相对中膜厚度对比注:与空白对照组比较，aP<0.001, bP<0.01；与妊娠组比较，cP<0.05

组别未增厚肺小动脉比增厚肺小动脉比闭塞肺小动脉比空白对照组(n=15)96.92.630.5MCT组(n=12)34.3a33.732.1妊娠组(n=12)94.94.710.4妊娠MCT 组(n=12)24.3a46.828.9

注:对照组与MCT组比较,aP<0.001; 妊娠MCT组与妊娠组比较，aP<0.001

3.妊娠对大鼠肺循环呈双向影响 血流动力学方面，妊娠MCT组较MCT组大鼠[(26.25±5.53)vs.(33.5±5.49)mmHg，P=0.004] PAP的降低,差异有统计学意义(图1)。肺动脉形态方面，妊娠MCT组较MCT组大鼠[ (3.55±0.81)vs. (2.27±0.84)个/mm2，P=0.001]有更多增厚的肺小动脉(表1)；妊娠组较空白对照组大鼠[(29.08±4.66)vs.(23.87±3.78)%，P=0.004]相对具有更厚的肺小动脉中膜(图3)。

讨 论

实验结果显示，MCT能够显著增加肺循环的压力，从血流动力学方面验证了PAH模型的成功建立。肺动脉高压患者诊断的金标准就是PAP的升高，本实验所有经MCT诱导的大鼠其PAP的增高都具有显著的统计学差异，已足够确定PAH模型的建立。而临床医生考量PAH患者病情的危重程度则要综合PAP及SAP的水平，所以经MCT诱导大鼠具有更高的PAP/SAP水平也更加验证了这一模型建立成功的可信度。

MCT损伤大鼠肺血管基本形态则从病理学角度验证了PAH模型的成功建立。氧化应激、肺循环内膜功能障碍及血管重塑都是导致PAH的重要原因[1]。MCT通过肺血管内膜功能障碍及血管重塑来破坏肺血管结构[20]，进而导致肺血管收缩、增殖及阻塞性改变，从而诱发肺血管阻力升高，这是其诱导肺动脉高压模型的机理[21]。肺血管高阻力限制了肺动脉血流，增加了肺主动脉及右心负荷，进而导致肺动脉及右心室压力升高[22]。本实验病理组织检查中，显著的肺血管增生增殖及阻塞性改变都得以复制，包括相对中膜厚度增厚、肺小动脉数量增多及出现闭塞小动脉。进一步验证了PAH大鼠模型建立的成功。

在进行血流动力学测量时(即合笼成功18d后)，已处于妊娠大鼠的孕晚期，此时增大的子宫可通过直视观察到，从而确定妊娠模型的成功。通过以上方法，确定了本实验结果中所统计妊娠组及妊娠MCT组大鼠符合预期研究模型的质量要求。

除以上结果，本实验还显示了妊娠因素对大鼠肺循环的特殊影响。首先，PAP及PAP/SAP的水平在妊娠MCT组明显低于MCT组大鼠，这说明妊娠过程对PAH存在保护性作用。但来自这两组大鼠的增厚肺小动脉数量，则在妊娠组增长的更为显著，这显示妊娠同样也能加重肺血管结构的破坏。另两组之间，妊娠组比空白对照组具有更厚的肺小动脉相对中膜厚度，也进一步验证了妊娠对肺血管结构带来的不良影响。这两个看似互相矛盾的结果，提示了妊娠对肺循环的影响可能存在更复杂的机制，妊娠期间可能同时存在保护肺循环与损伤肺血管的因子。下面是有关这一设想的一些证据。

大量临床资料统计显示，妊娠合并PAH患者的死亡事件多发生于终止妊娠之后。分娩后的第一周内被认为是临床上最危险的时间段[7]。分娩致使回心血量剧增极易导致此类患者发生心力衰竭，这已成为妊娠合并PAH产后死亡的首要原因[8-11]。其它重要的死因还包括妊娠高凝状态导致的肺栓塞及脑栓塞等。这些伴随妊娠的特殊病生理状态需要在终止妊娠6-8周后基本恢复到正常水平[23]。但是在这些统计资料中，还存在大于终止妊娠后8周甚至是终止妊娠半年后的远期死亡事件。所以，我们推测还存在某些与妊娠相关的因素，能够对肺循环造成影响，本研究实验结果中发现的肺小动脉形态学损伤性改变，由于其不可逆性，或许与终止妊娠后稍晚期肺动脉高压的死亡情况相关。

由于IPAH具有显著的年轻育龄女性高发倾向，许多研究开始关注性激素与PAH之间的关系[2, 24-26]。这一流行病学特征，显示出雌性激素具有加重PAH的影响。但另一项发现却与之相悖，即一旦患上PAH，女性患者通常比男性患者具有更轻的病情及更好的预后[27]。提示，雌性激素可能对PAH患者病情具有双向的影响。同时，雌性激素作为孕期显著增长的特征性激素，是妊娠期间最具代表性的特殊血清学成分之一。那么，妊娠后雌性激素水平变化，很可能就是实验中所观察到对肺循环具有双向作用的因子。

大量研究证明，女性特征性的雌激素及孕激素都具有明显扩张肺血管的作用[12]，这似乎可以解释女性PAH患者较男性病情轻的特点。或许与性激素对PAH肺循环的保护性作用有关。目前，对性激素加重PAH病情的确切机制尚无定论。大多动物实验将焦点放在对雌激素的主要活性成分雌二醇(17β-estradiol，E2)的研究上。一些动物实验发现，E2能促进肺血管的增殖，并且有促有丝分裂、促血管增生以及抗凋亡的作用，从而加重对肺血管的破坏，给肺循环带来的不利影响[26, 28]。低氧、炎症及某些药物的影响下，E2对肺循环的破坏性作用更会加重。所以，雌激素或许就是我们所猜想的这一重要因子。

目前，关于雌激素与PAH的研究很多，但不同的动物模型以及不同剂量的外源性雌激素，导致了实验的结果很不一致。值得注意的是，目前尚未出现任何一项直接在妊娠合并PAH大鼠模型上进行的相关研究。这为接下来的研究提供了方向。

综上所述, 本实验成功建立了妊娠合并PAH大鼠模型。同时，发现了妊娠对于PAH大鼠肺循环的双重影响。雌激素很可能是双重影响的主要介导者，在PAH患者妊娠期间，雌激素在扩张肺血管的同时，也加重了肺小动脉不可逆的组织学损伤。以上改变可能是妊娠对PAH肺循环双向影响的重要机制之一。