大鼠皮层梗死后同侧丘脑胶质细胞活化和炎性介质动态变化☆

刘可嘉王浩月李弘杰廖松洁余剑

大脑皮层局灶性梗死后，丘脑等远隔部位可发生继发性损害，与脑卒中后认知功能障碍和神经功能恢复不良等密切相关[1-3]。这种远隔损害机制尚未完全阐明，一般认为包括炎性反应在内的多种因素参与其中[4]。已经发现，脑梗死后数日至数月，远隔丘脑部位可继发胶质细胞活化和炎性介质释放，促使细胞凋亡和组织破坏，但结果并不完全一致[5-8]，仍缺乏对脑梗死后早期众多炎性因素动态变化的研究，而在早期根据不同炎性因素的变化进行适时调控将有可能成为临床潜在的治疗策略之一。本研究中，我们选用肾血管性高血压大鼠建立局灶性皮层梗死模型[9]，较全面地观察皮层梗死后早期阶段同侧丘脑胶质细胞激活与炎性介质释放的动态变化，探讨远隔损害早期可能的干预靶点。

1 材料与方法

1.1 研究对象从广东省医学动物实验中心购进70～100 g雄性SD大鼠，复制易卒中型肾血管性高血压模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP）[9]。 12 周后选取尾动脉压高于 180 mmHg且无自发卒中的大鼠以电凝法[10]行右侧大脑中动脉皮层支闭塞术 （middle cerebral artery occlusion,MCAO）。假手术和MCAO组在术后1、4、8 d取材，每组9只，共54只。改良神经功能缺损 评 分 （modified neurological severity scores，mNSS）[11]用于评价神经功能，分值越高表明神经功能缺损越严重。

1.2 脑组织处理3%戊巴比妥麻醉，每组6只经升主动脉灌注冰生理盐水冲净血液后开颅，在冰上分取出同侧丘脑，置液氮中速冻后再于-80℃冰箱保存；另3只用4%多聚甲醛灌注固定后完整取出脑组织，再后固定8 h，经蔗糖溶液脱水，用OCT包埋，制成冰冻切片，-40℃保存备用。

1.3 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色冰冻切片复温水化，先苏木素染色，再用盐酸乙醇分化、自来水返蓝，之后伊红染色，经酒精梯度脱水、二甲苯透明后，用封片胶封片，镜下观察拍照。

1.4 免疫荧光检测胶质细胞活化、炎性介质表达与神经元数目冰冻切片经复温水化后，高温修复，封闭，滴加一抗，分别是炎性介质白细胞介素6（IL-6，1∶100，Abcam， 兔源）、 肿瘤坏死因子 α（TNF-α，1∶100，Affinity，兔源）和细胞粘附分子（ICAM-1，1∶100，Proteintech，兔源），星形胶质细胞标记物 GFAP（1∶300，Atlas，小鼠源），小胶质细胞标记物 Iba-1（1∶400，Wako，兔源）以及神经元标记物 NeuN （1∶500，Abcam， 小鼠源）。 湿盒 4℃过夜，再选用Alexa Fluor 555山羊抗兔、Alexa Fluor 488或 594山羊抗小鼠二抗 （1∶500，Cell signaling Technology），室温避光1 h后封片，荧光显微镜下观察拍摄，统计GFAP、Iba-1及NeuN的数目。

1.5 Western blot检测炎性介质表达取出冰冻保存的丘脑，称重后用含PMSF的RIPA裂解液裂解，BCA试剂盒测定蛋白浓度，无菌水稀释配平浓度，煮沸变性。行SDS-PAGE垂直电泳，每孔30μg，转至PVDF膜，封闭1 h，加兔源性一抗 IL-6（1∶800，Abcam）、TNF-α（1∶500,Affinity）、ICAM-1（1∶1000，Proteintech）、β-actin（1∶1000，Cell signaling Technology），4℃摇床过夜后予HRP偶联的山羊抗兔二抗，室温摇床1 h，用ECL发光液（Millipore）显像。使用Image-J软件进行灰度值测定。

1.6 统计学分析用SPSS 20对数据行统计分析。正态分布数据用均数±标准差统计，采用单因素方差分析（ANOVA）比较多组间均数，用LSD-t检验进行两两比较；非正态分布数据用中位数、上下四分位数M（QL，QU）表示，并采用K-W检验比较。检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 神经功能评分假手术组和MCAO组的mNSS评分在术前均为0分。在术后1、4、8 d，假手术组均保持0分无变化，而MCAO组评分在各时间点均明显增加（χ2=26.818，P＜0.001），以术后 1 d[8.0（7.5， 9.0）分]最高，之后缓慢下降，术后 8 d[7.0（5.5， 7.0）分]时分值仍较高。

2.2 皮层梗死灶HE染色显示，假手术组脑冠状切面完整，未见梗死灶（图1，A），而MCAO 4 d组可见右侧皮层梗死灶，与未梗死区脱离（图1，B），而丘脑、中脑等远隔部位未见异常。

图1 HE染色示脑冠状面图像。A：假手术组；B：MCAO 4 d组。示梗死灶位于右侧大脑皮层（*）。标尺2 mm

2.3 胶质细胞活化、炎性因子表达与神经元数目变化免疫荧光（图2、表1）显示，与假手术组相比，MCAO术后1 d，GFAP标记的星形胶质细胞和Iba-1标记的小胶质细胞呈轻度活化，表现为胞体稍变大，但数量尚无明显差异；而在MCAO术后 4 d和 8 d，星形胶质细胞 （F=77.01，P＜0.001）和小胶质细胞（F=26.09，P＜0.001）均出现明显活化，表现为胞体变大，突起变粗，数量明显增多。 免疫荧光（图 3）和 western blot（图 4、表 2）共同提示炎性介质的表达：与假手术组相比，MCAO术后 ICAM-1（F=8.07，P＜0.001）、IL-6（F=9.90，P＜0.001）、TNF-α（F=9.52，P＜0.001）均有显著变化。通过两两比较，发现术后1 d仅ICAM-1表达增多，IL-6和TNF-α无明显改变；至术后4 d，三者表达均增多；术后8 d，ICAM-1和TNF-α仍维持高水平，而IL-6则回复至低水平。通过对NeuN标记的神经元进行计数，发现MCAO术后1 d神经元数目无明显改变，术后4 d，数目虽有减少，但尚无统计学意义，在术后8 d则明显减少 （F=7.45，P＜0.05）（图 5、表 1）。

表1 GFAP标记的星形胶质细胞、Iba-1标记的小胶质细胞和NeuN标记的神经元数目变化

图2假手术及MCAO后各时间点同侧丘脑GFAP和Iba-1的免疫荧光示意图。200倍，标尺50 μm。

图3免疫荧光示假手术及MCAO后各时间点同侧丘脑ICAM-1、IL-6、TNF-α 的表达。200倍，标尺50 μm。

3 讨论

本研究发现，在易卒中型肾血管性高血压大鼠大脑皮层局灶性梗死后早期 （术后1～8 d），在伴神经功能缺损的同时，同侧丘脑出现继发的炎性反应，但炎性细胞激活和炎性介质释放并不一致。星型胶质细胞和小胶质细胞从术后1 d起即激活并持续至术后8 d；而术后1 d炎性介质仅ICAM-1增多，术后4 d时IL-6和TNF-α开始增多，至8 d时，IL-6表达显著减弱回到初始水平，而ICAM-1和TNF-α仍维持高水平，此时，伴有同侧丘脑神经元数目的显著减少，神经功能缺损恢复缓慢，表明远隔丘脑的差异性炎性反应可能影响神经元存活与神经功能恢复。

表2假手术及MCAO后各时间点同侧丘脑炎性介质蛋白表达水平

图4 Western blot示假手术及MCAO后各时间点同侧丘脑ICAM-1、IL-6、TNF-α 的表达。

图5假手术及MCAO后各时间点同侧丘脑NeuN的表达。200倍，标尺 50 μm

既往对脑梗死后远隔损害的研究发现，远隔部位可出现炎性反应，并与神经细胞减少存在时间相关性，但因所使用动物模型和观察时间不同，结果并不一致，且缺乏对脑梗死后早期远隔部位众多炎性因素动态变化的研究[6，7]。本研究结果进一步证实了远隔丘脑在脑梗死后早期即可继发胶质细胞激活，且其出现早于神经元损害，提示对于远隔部位继发的炎性反应需及早进行干预，以减轻远隔神经元损伤和改善神经功能。

目前对免疫炎性机制在脑卒中后病理生理反应中的作用仍有争议。尽管在动物实验中显示有效，但多种针对免疫细胞和炎性介质的抗炎治疗并未在脑卒中的临床实验中显示出明显有益的效果[12]。炎性介质种类众多、在不同类型脑卒中后的表达部位、浓度、时间和活化信号等均不尽相同，只是单一地调控某种炎性介质结局往往不能尽如人意[12]，因此，我们推测，对多种炎性介质的变化进行动态观察并进行针对性干预是有意义的。本研究观察了3种代表性的炎性介质ICAM-1、IL-6和TNF-α在脑梗死后远隔丘脑早期的动态变化。ICAM-1是一种细胞间粘附分子，而IL-6和TNF-α则是强效的促炎因子[13]，结果发现，三者虽然都有不同程度增高，但变化趋势不同，ICAM-1增高更快速（术后1 d），可能是早期介导炎性发展的重要因子；而IL-6先高（术后4 d）后低（术后8 d），提示其作用具有短效性；TNF-α则在术后4 d表达增多，并持续至8 d。三种炎性因子中，ICAM-1和IL-6在同侧丘脑的表达尚无报道，而LOOS M等[6]报道TNF-α在术后1 d上调，3 d时降低，与本研究存在差异，差异可能与模型有关。LOOS M等采用的是正常血压大鼠，而本研究所采用的是RHRSP模型，能更好地模拟临床并能提高造模成功率[14]。

本研究对大鼠皮层梗死后早期远隔丘脑继发的炎性反应进行了动态观察，发现不同炎性介质的释放具有差异性，且早于神经元损伤，这为今后对其进行多靶点的精准调控提供了实验证据，为减轻远隔损害提供了一种可行的治疗方法。