二甲双胍治疗氯氮平所致脂质代谢紊乱的实验研究☆

张丽虹 古云 杨骅 杨国伟 冯丽娟

氯氮平（clozapine，CLO）是临床目前常用的非典型抗精神病药物 （atypical antipsychotic drug,AAPD）之一，其对急慢性精神分裂症均有良好的疗效[1-3]。AAPD在临床应用过程中，脂质代谢紊乱是最突出和最棘手的副反应之一，其发生与胆固醇调节元件结合蛋白 （sterol regulatory elementbinding proteins,SREBP）信号通路密切相关[4-5]。最近研究发现，CLO可以促进肝细胞SREBP的表达，激活下游相关靶基因和酶，进而增加脂肪酸和胆固醇的生物合成[6]。二甲双胍（metformin，MET）是治疗2型糖尿病的一线药物，可降低糖尿病患者空腹及餐后高血糖[7]。近年研究发现，MET除具有良好的降糖作用外，还兼有控制体重、调节血脂、保护心血管等作用，其机制可能与MET抑制胆固醇合成和贮存，从而降低血清甘油三酯和总胆固醇水平相关[8]。本研究通过动物实验，考察MET对CLO所致脂质代谢紊乱的调节作用，探讨防治AAPD所致脂质代谢紊乱的新策略，同时为临床其他原因所致脂质代谢紊乱的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠 36只，SPF级，体重200～230 g，由上海斯莱克动物研究中心提供，合格证号：4300470023586。动物实验中心饲养，室温（23±2）℃，相对湿度 50%～60%，明暗周期 12 h/12 h，正常饮食（3%脂肪，3.2 kcal/g）、饮水。大鼠在单独的笼中分开饲养，每日记录大鼠体重和食物摄入量。所有实验动物饲养及操作均符合动物管理条例，遵循“3R”原则。

1.2 动物分组与给药方法大鼠随机分为对照组、CLO组、CLO+MET组、CLO+A769622组等 4组，每组9只。由于CLO在大鼠体内半衰期较短，通过腹腔注射给予，剂量为15 mg/kg[9]，CLO（武汉世吉药业有限公司）用0.9%生理盐水（含0.2%的醋酸和0.5%吐温80）配制；MET灌胃给药，剂量为30 mg/kg[9]，MET（Eastbang 制药公司）用 0.9%生理盐水配置；AMPK激动剂A769662灌胃给药，剂量为 20 mg/kg[9]，A769622（Sigma 公司）用 1%的DMSO配制。连续给药4周，每日根据大鼠体重调整给药剂量。

1.3 检测方法给药第4周末，禁食12 h后处死大鼠，取大鼠躯干血及肝脏中叶组织，血样离心后和肝脏组织迅速放入液氮中，-80℃冰箱中储存。

1.3.1 生化指标测定 血清游离脂肪酸 （free fatty acid synthase,FFAs）和总胆固醇（total cholesterol,TC）采用酶法测定，按试剂盒（Sekisui Medic，日本）说明书完成测定，甘油三酯（triglyceride,TG）用TG甘油磷酸氧化酶实验测定（Abbott Laboratories，美国），葡萄糖通过己糖激酶试剂盒测定（Abbott Laboratories,美国）。肝脏中TC和 TG根据Folch法用氯仿—甲醇（体积比2∶1）混合液提取，然后使用试剂盒测定（Cayman Chemical，美国）。

1.3.2 腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平检测 采用western blot法检测腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）磷酸化水平。取大鼠肝脏组织匀浆后提取总蛋白，并用Bradford法进行蛋白定量。取处理后的蛋白样品50 μg进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。分别加入以下抗体，4℃孵育过夜：Phosphor-AMPK（Thr172）（1∶2000）、AMPK （1∶2000）、β-actin（Proteintech;1∶4000）。β-actin为内参，TBST 洗膜3次后显影。图像分析用Quantity One（version 4.6）分析软件。

1.3.3 脂质代谢关键酶mRNA检测 按照试剂盒（invitrogen，美国）说明书用Trizol试剂提取肝脏组织总RNA。采用Real-Time qPCR分析脂肪酸合成关键酶、胆固醇代谢关键酶mRNA的表达水平，包括1型胆固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding protein type 1，SREBP1）、乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase 1c，ACC1）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）、SREBP2、羟甲基戊二酰辅酶A合酶 （hydroxymethyl glutaryl coenzyme A synthase,HMGCS）、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶 （hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGCR）、低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor,LDLR）。PCR定量在Biorad Cx96检测系统进行（Biorad，美国），使用SYBR绿色 PCR 工具（Applied Bio-systems,USA），基因引物见表1。实验条件为95℃预变性10 min，95℃变性 15 s，50℃退火 2 min，循环 40次，60℃延伸1 min。PCR产物定量用β-actin作为内参对照。

1.4 统计学方法采用SPSS 18.0进行统计学分析。体重和摄食数据采用重复测量的方差分析进行检验，以处理方式为组间因素，时间为组内因素。血清和肝脏中各脂质代谢物含量、AMPK磷酸化水平、脂肪酸合成和胆固醇代谢关键酶mRNA表达水平组间比较采用单因素方差分析，并用LSD法两两比较。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 体重与食物摄取情况对于大鼠体重，时间与分组交互效应有统计学意义（F=9.65，P＜0.01），见图1；对于食物摄取量，交互效应无统计学意义（F=2.91，P=0.41），见图 2。从第 1周开始 CLO 组、CLO+MET组、CLO+A769662组相比对照组体重都较低（P＜0.05），CLO+MET 组相比 CLO 组、CLO+A769662 组体重较低（P＜0.05）。

图1 各组大鼠体重变化。与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表1 real-time qPCR分析使用的引物序列

图2 各组大鼠摄食量变化

2.2 血清与肝脏中各脂质代谢物水平TG（F=57.35，P＜0.01）、FFA（F=10.56，P＜0.01）、TG（F=5.43，P＜0.01）在4组中差异有统计学意义。CLO组、CLO+MET组、CLO+A769662组相比对照组血清中TG、FFA 水平增加（P＜0.01）；CLO 组（P＜0.01）、CLO+MET组 （P＜0.05）相比对照组血清中TC水平增加，血清中葡萄糖（glucose）水平相比对照组无明 显 增 加 （P＞0.05）；CLO、CLO+MET、CLO+A769662组相比对照组肝脏中TG水平增加有统计学意义（P＜0.01）；CLO 组（P＜0.01）、CLO+A769662组（P＜0.05）相比对照组肝脏中TC水平增加。见表2。

2.3 AMPK磷酸化水平各组间差异有统计学意义（F=9.26，P＜0.01）。 CLO+MET、CLO+A769662 组相比对照组AMPK磷酸化水平增加 （P＜0.01），而CLO 组相比对照组、CLO+MET、CLO+A769662组AMPK磷酸化水平减少（P＜0.01）。见图3与表2。

图3 western-blot法检测各组大鼠AMPK磷酸化水平的电泳图

2.4 脂肪酸合成关键酶mRNA表达水平SREBP1mRNA（F=10.42，P＜0.01）、AAC1mRNA （F=9.83，P＜0.01）、FASmRNA（F=5.43，P＜0.01）组间差异有统计学意义。CLO组相比对照组、CLO+MET组及CLO+A769662组脂肪酸合成关键酶SREBP1mRNA表达增加（P＜0.01），同时其下游ACC1mRNA（P＜0.01）、FASmRNA （P＜0.05） 表达也增加；CLO+MET、CLO+A769662组相比对照组SREBP1mRNA和其下游ACC1mRNA 表达增加 （P＜0.01）；CLO+A769662组相比对照组、CLO组和CLO+MET组FASmRNA 表达减少（P＜0.01）。见表 3。

表2各组大鼠血清和肝脏中脂质代谢物水平

表3各组大鼠AMPK磷酸化水平、脂肪酸和胆固醇代谢关键酶mRNA表达水平

2.5胆固醇代谢关键酶mRNA表达水平SREBP2mRNA（F=4.36，P＜0.05）、HMGCRmRNA（F=8.61，P＜0.01）、LDLRmRNA（F=5.17，P＜0.05）各组间差异有统计学意义。CLO 组（P＜0.01）、CLO+A769662组 （P＜0.05）相比对照组胆固醇合成关键酶SREBP2mRNA表达增加，其下游HMGCSmRNA表达 增加 无统 计学 意 义 （P＞0.05）；CLO、CLO+MET、CLO+A769662组相比对照组HMGCRmRNA表达增加（P＜0.01）；CLO（P＜0.01）、CLO+A769662（P＜0.05）组相比对照组LDLRmRNA表达增加。见表3。

3 讨论

随着AAPD的推广应用，精神分裂症的疗效明显改善，严重的锥体外系副反应大大减少，但药物引起的躯体问题如糖尿病、心血管疾病等却明显增加，严重影响患者治疗的依从性，增加临床选药的局限性。而促使发生这些躯体疾病的危险因素包括肥胖、血脂障碍、胰岛素抵抗、糖代谢紊乱和高血压等[10-11]。有研究显示，临床常用的一些AAPD包括氯氮平、奥氮平、利培酮、喹硫平等，对机体代谢有显著的负面影响，大大增加首发精神分裂症患者代谢综合征的发病率[12]。患者体重增加和血脂异常是这些AAPD临床使用过程中最突出的代谢副反应，也是代谢综合征的高危因素[13]。研究者普遍认为AAPD致脂质代谢紊乱的机制可能与药物阻断中枢5-羟色胺2c受体 （5-HT2c）和组胺H1受体，激活下丘脑的腺苷酸活化蛋白激酶，进而刺激食欲有关[14]。然而越来越多研究也表明，AAPD可以在不影响摄食的情况下对脂质代谢直接产生作用[15]。

本研究结果显示CLO可能会导致大鼠体重降低，其具体机制尚未明确，可能的原因是CLO引起的代谢紊乱与下丘脑神经传导无关，通过其对脂肪细胞功能的直接作用改变外围脂质代谢，而不依赖于药物刺激食欲以增加食物摄取，进而导致体重增加。这与之前的文献报道结果一致[15]。

MET和A769622都属于AMPK激动剂，不论是单独给予大鼠CLO，还是在给予大鼠CLO的同时分别给予MET或A769622，结果都显示大鼠的体重相比对照组有所降低，说明AMPK的这两个激动剂均没有缓解CLO对大鼠体重降低的作用。同时，本研究结果也显示CLO和MET均对大鼠摄食量没有明显影响，说明CLO和MET对脂质代谢的干预可能不是通过增加摄食间接引起，其机制可能是直接调控SREBP[16]。SREBP是膜结合的转录因子，通过调节下游一系列靶基因参与脂质自稳态的许多方面，是调节细胞脂质自稳态的“枢纽”。目前，已发现肝脏有3种SREBP：SREBP-1（包 括 SREBP-1a 和 SREBP-1c），SREBP-2。SREBP-1a主要促进脂肪酸的大量合成。机体通过SREBP精细调节着脂质合成的网络，当SREBP过度表达时则可引起循环系统中胆固醇和甘油三酯增高，以及外周脂质蓄积[16]。

本研究结果显示CLO和MET对大鼠脂质代谢都有一定影响，可调节血清中TG、TC、FFA水平，以及肝脏中TG水平、TC水平。CLO组相比对照组明显增加了血清中TC、TG、FFA水平，以及肝脏中TG、TC水平。本研究还发现，MET及AMPK激动剂A769622使AMPK磷酸化水平明显增加。AMPK被磷酸化后，抑制了SREBP1mRNA及其下游ACC1、FASmRNA的表达，从而减少脂质合成[5]。而CLO则抑制AMPK的磷酸化，其通过增加SREBP1mRNA及其下游ACC1、FASmRNA的表达，增加脂质合成[17]。

最近研究发现，CLO、奥氮平和利培酮可以在转录水平上促进肝细胞SREBP表达，激活下游相关靶基因和酶，进而增加脂肪酸和胆固醇的生物合成；而单剂量氯氮平和奥氮平就可以上调大鼠SREBP并引起肝脏和脂肪组织中脂质蓄积[17-18]。

胆固醇合成关键酶包括SREBP2、HMGCS及LDLR。AMPK激动剂MET和A769662都可以激活AMPK，通过调节胆固醇合成的关键酶，来影响血清及肝脏中胆固醇水平[19]。本研究发现CLO明显增加胆固醇合成关键酶SREBP2mRNA及其下游HMGCSmRNA、LDLRmRNA表达，进而增加血清及肝脏中胆固醇的水平。

因此，通过诱导肝脏中SREBP的表达而显著促进脂质的生成，是氯氮平等AAPD致脂质代谢紊乱的重要机制之一。与SREBP相关的病理生理学改变是导致代谢综合征中诸如肥胖、血脂紊乱和心血管疾病的关键原因，而通过抑制SREBP通路来辅助治疗AAPD引起的代谢副反应也将有广阔的应用前景，为开发低副反应的抗精神分裂症药物提供新靶点，同时为临床其他原因所致脂质代谢紊乱的治疗提供重要参考。