丝素蛋白基药物缓释功能肠道支架的研制

谢旭升，李 刚，王晓沁，赵泽宇，李 翼，兰 平

(1.苏州大学 a.纺织与服装工程学院 ; b.现代丝绸国家工程实验室， 江苏 苏州215123；2.曼切斯特大学 材料学院， 曼切斯特 M13 9PL 英国；3.中山大学 附属第六医院结直肠外科， 广东 广州 510655)

结直肠癌是人类第三大高发病率和死亡率的癌症，且逐年增多，已经引起人们的广泛关注[1-2]。其主要发病因素包括家族遗传和不良饮食习惯如高脂肪、低纤维以及吸烟饮酒等，外界环境因素包括血吸虫病、盆腔放射等[3-5]。肠梗阻是结直肠癌的常见症状之一，其发生率高达5%～20%，有时甚至为其首发症状，如果不进行干预治疗，5年内患者的死亡率为80%～90%。针对肠癌患者，常用的治疗方法是手术配合放化疗治疗[6-7]。然而，放化疗引起的全身副作用大，危害患者的正常身体健康，而且化疗药物经代谢后，肿瘤部位的有效药物浓度非常低，不能达到有效的治疗效果[8-10]。对于肿瘤引起急性肠梗阻者，急诊手术风险大、不能耐受手术者以及多发转移和失去手术机会的晚期患者，放置肠道支架解除梗阻，进行姑息治疗后再配合化疗等辅助治疗手段，是一个有效的治疗思路[11]。

支架植入作为一种新兴的治疗结直肠癌的有效辅助手段，据统计其理论与临床的成功率分别为90%与88%[12-13]。病人在进行结肠镜检查后确定肠梗阻位置后，准确植入肠道支架，其不仅可以支撑扩张肠道、缓解梗阻，恢复病人排便功能；对于可以切除的肿瘤疾病，支架植入作为前期的辅助治疗方法，一定程度缓解病情，为后期的化疗或者放疗提供机会[14-16]。

近年来，一种从植物中提取的化合物——姜黄素的出色抗癌功能越来越引起研究者的关注。姜黄素的分子结构(如图1所示)中的酚醛基侧链和中央的亚甲基碳基团都可以脱掉一个氢原子，形成稳定的无毒害的自由基，它能选择性地诱导癌细胞凋亡而对正常细胞作用很小[17-19]。丝素蛋白是一种含有人体必需氨基酸的天然蛋白质，具有良好的生物相容性和力学性能，在体内降解缓慢，适合用于药物缓释载体材料[20-23]。

本文开发一种新型丝素蛋白复合肠道支架，内层为采用纬编工艺制备的聚二氧六环酮(PDO)可降解裸支架，外层为采用烘干成膜工艺制备的丝素蛋白搭载姜黄素药膜，其制备流程如图2所示。将探讨裸支架的力学性能，以及药膜的微观形貌、二级结构、晶体结构和药物缓释性能，并分析其中的影响因素。

图1 姜黄素分子结构式Fig.1 Curcumin molecular structure

图2 覆膜肠道支架的制备过程Fig.2 Preparation of covered intestinal stent

1 试验材料及方法

1.1 试验材料及仪器

桑蚕丝(购自嵊州市协和丝绸有限公司)；PDO单丝(国标规格3-0)(购自韩国三洋公司)；聚乙二醇(PEG-400，相对分子质量为400，优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；姜黄素(Sigma)；其他所用试剂均为分析纯。

自制ST-06SL型小口径圆纬织机；日立S 4800型冷场发射扫描电子显微镜(FE-SEM): 日本Hitachi公司；Thermo Nicolet 5700 型傅里叶变换红外光谱仪: 美国尼高力仪器公司；X射线衍射仪: 荷兰飞利浦公司；Bio-Tek synergy H1型酶标仪。

1.2 试验方法

1.2.1 内层PDO裸支架的制备

内层裸支架采用直径为0.3 mm 的PDO单丝，选择小口径圆纬织机: 针筒直径为20 mm，针齿数为22，织物张力为2 N，弯纱深度为3 mm，编织速度为3 m/min。按照上述参数，编织30 min后得到长度为60 mm、内径为20 mm的裸支架。将所制裸支架嵌套在直径为20 mm的管状模型上，进行热定型处理15 min，热定型温度为80 ℃。

1.2.2 外层药膜的制备

室温下，经过溶丝、透析、离心及浓缩，得到质量分数为5%、10%及15%的丝素蛋白溶液。姜黄素溶解于PEG-400中，再与丝素蛋白溶液均匀混合，通过磁力搅拌和超声分散，得到均匀稳定的混合液。

选择质量分数为10%的丝素蛋白溶液，质量分数为40%及100%的PEG-400溶液，质量浓度为100、50、25、10及5 mg/mL的姜黄素溶液，按上述操作依次混合，结果如图3所示，得到姜黄素的最佳质量浓度为5 mg/mL。

选择丝素蛋白溶液的质量分数为5%、10%及15%， PEG-400与丝素蛋白溶液的质量配比为1∶3(姜黄素的质量分数为0.125%)、1∶6(姜黄素的质量分数为0.071%)及1∶9(姜黄素的质量分数为0.056%)，温度为25、60及80 ℃，设计9组正交试验，如表1所示，进行成膜试验。

(a)姜黄素质量浓度为100 mg/L,PEG-400质量分数为100%

(b)姜黄素质量浓度为100 mg/L,PEG-400质量分数为40%

(c)姜黄素质量浓度为50 mg/L,PEG-400质量分数为40%

(d)姜黄素质量浓度为25 mg/L,PEG-400质量分数为40%

(e)姜黄素质量浓度为10 mg/L,PEG-400质量分数为40%

(f)姜黄素质量浓度为5 mg/L,PEG-400质量分数为40%图3 质量分数为10%的丝素蛋白溶液与不同质量浓度的姜黄素溶液和不同质量分数的PEG-400溶液的混合溶液Fig.3 The mixed solution of silk fibroin, curcumin with different concentrations and PEG-400 with mass fraction of 10% different mass fraction表1 外层药膜的正交试验参数 Table 1 The orthogonal experimental parameters of outer drug membrane

试验号ABC丝素蛋白质量分数/%PEG-400与丝素蛋白溶液的质量配比温度/℃1#11151∶3常温2#12251∶6603#13351∶9804#212101∶3605#223101∶6806#231101∶9常温7#313151∶3808#321151∶6常温9#332151∶960

1.2.3 药膜形貌表征

随机选取外层药膜样品，并对其进行喷金处理90 s，在日立S 4800型场发射扫描电子显微镜下观察药膜表面形态,放大倍数为5 000。

1.2.4 二级结构表征

随机选取纯丝素膜和9组药膜样品，剪成粉末状，取2 mg样品和20 mg的溴化锂在玛瑙研钵中研磨，放入模具，压成薄片，利用Thermo Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪检测，分析其二级结构。

1.2.5 晶体结构表征

随机选取PEG-400与丝素蛋白溶液的质量配比为1∶3、1∶6及1∶9的药膜样品，剪成粉末状，选用150目筛子筛选样品，进行下一步测试。利用X射线衍射仪和超能探测针计数器记录5°～45°之间的衍射强度曲线。

1.2.6 药物缓释表征

将不同载药量的药膜进行水蒸气处理6 h，使其不溶于磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)。精确量取药膜装于5 mL离心管内，加入2 mL 磷酸盐缓冲溶液，密封后置于恒温摇床(37 ℃，100 r/min)。一定时间间隔吸取0.5 mL待测液，同时滴加0.5 mL新鲜磷酸盐缓冲溶液，测定姜黄素(波长为425 nm)的累积释放率。

2 结果及讨论

2.1 支架力学性能

支架管壁厚度为0.3～1.5 mm，节距为5～10 mm，轴向密度为15～20束/cm，单位质量为0.03～0.06 g/cm。所获得支架经过热定型后，其径向支撑力为30～240 cN，纵向拉伸强度大于20 MPa，横向拉伸强度大于10 MPa。

2.2 不同参数对药膜形貌的影响

外层药膜借助支架支撑力作用，直接贴合病灶部位，进行缓释治疗作用。因此，药膜表面平整度及空隙对于治疗效果至关重要[24]。利用PEG-400诱导丝素蛋白成胶，然后风干成膜，得到了不溶于水的丝素蛋白膜，不同参数的药膜外观形貌如图4所示。从图4可以看出，7#药膜透明度高，表面平整光滑，不存在空隙。因此，外层药膜的最佳成膜工艺参数为: 丝素蛋白质量分数15%，PEG-400与丝素蛋白溶液的配比1∶3，温度80 ℃。

(a) 1#

(b) 2#

(c) 3#

(d) 4#

(e) 5#

(f) 6#

(g) 7#

(h) 8#

(i) 9#图4 不同参数的药膜外观形貌Fig.4 Morphology of drug membrane with different parameters

2.3 红外光谱分析

文献[25-26]研究表明，酰胺I(1600～1700 cm-1)中，β-折叠的最大吸收峰在1616～1637 cm-1，无规卷曲的最大吸收峰出现在1638～1655 cm-1，α-螺旋的最大吸收峰在1656～1662 cm-1，β-转角的最大吸收峰在1663～1696 cm-1。纯丝素蛋白膜和不同参数条件下所制药膜的傅里叶变换红外光谱如图5所示。由图5可知，纯丝素蛋白膜主要以silk Ⅰ的结构存在，而不同参数药膜的特征吸收峰发生了明显的偏移，说明丝素蛋白在处理后发生了构象上的转变，由silk Ⅰ结构转变为silk Ⅱ结构。

图5 纯丝素膜及不同参数药膜的傅里叶变换红外光谱图Fig.5 FT-IR spectra of silk membrane and drug membrane with different parameters

图6 配比为1∶3、1∶6及1∶9药膜的X射线衍射光谱图(丝素蛋白质量分数为15%，温度为80 ℃)Fig.6 X-ray diffraction pattern of drug membrane with different ratio of 1∶3，1∶6 and 1∶9 (silk fibroin mass fraction was 15%, temperature was 80 ℃)

2.4 X射线衍射分析

纯丝素蛋白膜主要以silk I的结构存在，为了探究姜黄素的质量分数对丝素蛋白结构的影响，选取丝素蛋白质量分数为15%，温度为80 ℃， PEG-400与丝素蛋白溶液的质量配比分别为1∶3、1∶6及1∶9[27]，观察不同配比情况下，药膜中丝素蛋白结构的转变。不同配比药膜的X射线衍射光谱结果如图6所示。由图6可知，药膜中丝素蛋白结构均转变成silk II，在20.16°处出现了衍射峰，这种现象与FT-IR谱图显示的结果一致。

2.5 药物缓释分析

选取丝素蛋白质量分数为15%，温度为80 ℃， PEG-400与丝素蛋白的质量配比分别为1∶3、1∶6及1∶9不同参数的药膜中姜黄素的释放曲线如图7所示。由图7可知，载药量越高，药物释放速率越大，累积释放率越高。载药量不同的药膜约在200 h内持续释放，400 h 达到药物最高释放浓度，其中，药物最高累积释放质量浓度为(13.32±0.80)mg/L,最高累积释放率为(98.67±5.93)%。由此说明所制药膜具备很好的药物缓释性能。

图7 不同载药量药膜的药物缓释曲线Fig.7 In vitro drug release profile of drug membrane with different composition

3 结 语

本文制备了一种新型丝素蛋白复合肠道支架，并探讨了内层支架力学性能，外层药膜的形貌结构、二级结构及药物缓释性能。研究结果表明: 当丝素蛋白质量分数为15%、PEG-400与丝素蛋白溶液的质量配比为1∶3(姜黄素的质量分数为0.125%)、温度为80 ℃时，可以制备出最佳药膜；相较于纯丝素蛋白膜，药膜中的丝素蛋白的构象由silk Ⅰ转变为silk Ⅱ。丝素蛋白搭载姜黄素纳米纤维可以实现药物的稳控释放，具备优良的药物缓释性能。因此，丝素蛋白基药物缓释功能肠道支架在治疗结直肠患者过程中具备一定的潜在价值。