葫芦籽油中脂肪酸成分分析及分离纯化工艺研究

木太里普·吐逊， 翁幼武， 蒲 文， 尹 辉， 麦合苏木·艾克木

(1乌鲁木齐市中医医院药学部， 乌鲁木齐 830000； 新疆医科大学 2第一附属医院药学部， 乌鲁木齐 830054； 3维吾尔医学院， 乌鲁木齐 830011)

葫芦籽为葫芦科植物葫芦[Lagenaraiasiceraria(Molina)Standl.]的成熟种子，是药食同源药材，主要化学成分为油脂类、蛋白质类、氨基酸类、三萜皂苷类及维生素等，含有钙、铁、镁、锌等多种微量元素[1]，具有退热清肝、润燥解渴、利尿降糖等作用，临床上常用于治疗糖尿病、肝炎、发热发烧、心烦口渴等症的治疗[2]。研究报道[3-6]，不饱和脂肪酸类具有补脑健脑、清理血栓、调节血脂、改善血液微循环等诸多生物活性。目前葫芦籽主要以粗加工食品形式使用，尚未深加工产品，至今有关葫芦籽油中脂肪酸的组成及分离方面的研究报道甚少。本研究采用GC-MS法对葫芦籽油中的脂肪酸相对含量进行测定分析，采用尿素包合法确定了葫芦籽油中脂肪酸的最佳分离纯化工艺，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器7890A-5975c型 GC-MS联用色谱仪 (美国Agilent 公司)，HP-INNOWax型石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)(美国Agilent 公司)，GZX-GFC型电热恒温鼓风干燥箱(上海庚庚仪器设备有限公司)，N-1100D型蒸发仪(上海弘懿仪器设备有限公司)，AUY220型电子分析天(日本岛津公司)，DF-101T型集热式恒温加热磁力搅拌器(上海坦泽仪器设备有限公司)，KQ-250DA型超声清洗器(南京晓晓仪器设备有限公司)，HH-4型电热恒温水浴锅(常州市万合仪器制造有限公司)。

1.2试剂石油醚(30～60℃)、异辛烷、二氯甲烷、氯仿、甲醇、盐酸标准溶液、乙酸乙酯、冰乙酸、酚酞溶液、淀粉溶液(天津市致远化学试剂有限公司)，硫代硫酸钠(常州市海拓实验仪器有限公司，批号20180105)，碘化钾(常州市海拓实验仪器有限公司，批号20170824)，氢氧化钠(常州市海拓实验仪器有限公司，批号20171229)，尿素(常州市海拓实验仪器有限公司，批号20170308)，试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3药材葫芦籽药材2017年8月由新疆维吾尔自治区维吾尔医院药房提供，经该医院安尼瓦尔·塔力甫主任药师鉴定为葫芦科植物葫芦[Lagenaraiasiceraria(Molina)Standl.]的成熟种子。

2 方法与结果

2.1葫芦籽油的提取及其质量分析称取葫芦籽粉末10.0 g，105℃烘干30 min，用石油醚(沸程30～60℃)索式提取8 h，回收石油醚，即得葫芦籽油，葫芦籽油的提取率为45.3%。按GB/T 5525-2008法测评透明度、色泽、气味、滋味；按GB/T 5530-2005测定酸值；按GB/T 5534-2008测定皂化值；按GB/T 5538-2005测定过氧化值；按GB/T 3780.1-2015测定碘值。结果葫芦籽油为香味较淡的半干性黄色透明液体，比重为0.92，酸值为1.8，皂化值为209，碘值为116.14，过氧化值为2.3，符合植物原油的标准。

2.2葫芦籽油脂脂肪酸成分分析[7-8]称取“2.1”项下葫芦籽油0.2 g置于25 mL试管中，加入石油醚(沸程60～90℃)1 mL和乙醚1 mL溶解，再加入0.2mol/L NaOH-MeOH 溶液2 mL，40℃水浴30 min，冷却，滴加2 mL饱和NaCl水溶液，由无水硫酸钠对所得上清液进行干燥处理，冷却待用。GC条件：HP-5MS 石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升温控制柱箱温度，50℃ 起始10℃/min升到300℃保持10 min，载气(He)流速1.0 mL/min，进样量0.3 μL，分流比50∶1。MS条件：EI源(电子轰击离子源)，电子束能量70 eV，离子源与传输线温度分别为230℃、280℃；质量扫描区间为 30～600 mz。所得数据由Chem station工作站处理，参照标准质谱库Nist14，进行质谱图计算机检索。借助峰面积归一化法，对所有化合物的相对含量逐一求解。葫芦籽油主要脂肪酸成分为亚油酸58.64 %、棕榈酸12.16%、油酸11.85 %、硬脂酸7.88%、花生酸甲酯1.11%，见表1。

表1 葫芦籽粗脂肪主要脂肪酸分析

2.3葫芦籽油脂不饱和脂肪酸的尿素包合法分离纯化工艺[9-10]称取葫芦籽油脂40 g溶于1 mol/L NaOH-甲醇溶液，65℃水浴下磁力搅拌回流3 h，减压浓缩回收溶剂，加入蒸馏水溶解，用盐酸溶液(1 mol/L)调节pH值为3，用石油醚(沸程30～60℃)反复萃取使溶液pH值为7，滴加无水硫酸钠，脱水，抽滤，回收溶剂，加入适宜比例的甲醇与尿素65℃水浴下磁力搅拌，待溶液澄清，室温冷却，放入冰箱冷冻，即得饱和的脂肪酸结晶沉淀，滤去结晶沉淀，回收溶剂，将浓缩物放入分液漏斗内用蒸馏水反复洗脱，洗去尿素，调溶液至pH值为3，用石油醚反复萃取，对石油醚层加以合并，再用蒸馏水反复洗涤，用无水硫酸钠干燥，抽滤，回收溶剂即得葫芦籽油脂不饱和脂肪酸。采用L9(34)正交实验，以脂肪酸碘值为指标考察A(脂肪酸尿素比例)、B(搅拌处理时间)、C(包合时间)和D(包合温度)4个因素对葫芦籽油脂不饱和脂肪酸分离纯化的影响，各因素的主次分别为A>C>B>D，即脂肪酸尿素比例对葫芦籽油脂不饱和脂肪酸的分离纯化结果影响最大，其次为包合时间和搅拌处理时间，包合温度影响最小。由方差分析得知脂肪酸尿素比例、搅拌处理时间和包合时间对包合结果的影响差异用统计学意义(P<0.05)。尿素包合法对葫芦籽油不饱和脂肪酸的最优纯化工艺为：A2C3B1D1，即脂肪酸尿素比例1∶3、搅拌处理时间1 h、包合时间24 h、包合温度0℃，见表2-4。

表2 正交实验因素水平

表3 尿素包合法L9(34)正交实验结果

表4 方差分析表

注：*有显著性影响，F0.05(2,2)=19。

2.4验证实验按照优选纯化工艺条件，即脂肪酸尿素比例(1∶3)溶解于8倍量的甲醇中，搅拌处理1 h后，在0℃下静止24 h，结果葫芦籽油中脂肪酸回收率为22.54%，碘值为165.97，脂肪酸含量从70.49%提高到91.67%。

3 讨论

葫芦籽是药食兼用药材，葫芦籽油在临床及民间多用于心血管疾病、糖尿病、疼痛、失眠的治疗，其功能取决于脂肪酸组成及含量，因此对其脂肪酸组成及分离纯化工艺研究具有较高的实际意义。亚油酸在人体中不能合成必须脂肪酸之一，其共轭体CLA具有提高免疫力、抗氧化、抗突变及降低人体胆固醇等作用，已成为保健食品领域的研究热点[11-12]。本研究通过L9(34)正交设计实验，采用尿素包合法，以碘值为指标，考察脂肪酸尿素比例、包合温度、包合时间和搅拌处理时间对葫芦籽油脂不饱和脂肪酸分离纯化的影响，该纯化工艺操作简便、稳定性好，适用于葫芦籽油脂中脂肪酸的分离纯化。