脓毒血症性急性肾损伤的发生机制

马成龙，曾加礼

脓毒血症是指致病菌感染导致的宿主反应紊乱，引发的致命性器官功能障碍的病症[1-2]。急性肾损伤（AKI）是脓毒血症常见且最严重的并发症[3]。脓毒血症性AKI的主要临床表现为肾小管上皮细胞出现急性损伤，提示患者病情加重，甚至可能引起多脏器衰竭。研究表明，脓毒血症性AKI的发病机制与肾脏血流动力学变化、炎症介质浸润、肾脏细胞凋亡等相关[4]，其中肾小管上皮细胞凋亡可能起重要作用[5]。有研究报道，Tec非受体型激酶与脓毒血症的发病机制相关，成为治疗脓毒血症的新靶点[6]，但是Tec非受体激酶在脓毒血症AKI发病中扮演什么角色，是否与脓毒血症AKI的发病过程相关，尚未得知。因此，本研究分析讨论了Tec非受体激酶在脓毒血症性AKI发病过程中的变化，探讨其在脓毒血症性AKI发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备 Immun-blot PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）；ECL化学发光试剂盒（Pierce公司，美国）；LC3-Ⅱ及 Beclin-1的蛋白单克隆抗体（Pierce公司，美国）；Experion全自动电泳系统（Bio-rad公司，美国）。

1.2 动物分组及样本采集 选取健康雄性清洁级雄性SD大鼠（中科院上海实验动物中心，合格证书2015-025）32只，随机分为2组，每组16只，常规饲养7 d。模型组给予腹腔注射脂多糖（LPS）20 mg/kg建立脓毒血症模型，建模成功后进行充分的液体复苏。正常组给予腹腔注射等量生理盐水。分别在建模后1、24和48 h，麻醉动物，心脏穿刺取血，置于EP管中静置，待凝固后于37℃水浴30 min，离心分离血清备用（当天检测）。此外，在建模后1、24和48 h，每组各随机选择4只大鼠，取右肾上极组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋、切片，苏木素伊红（HE）染色，于显微镜下观察肾小管细胞形态。

1.3 检测指标

1.3.1 血生化指标 使用A720全自动生化分析仪(北京松上技术有限公司)，采用紫外-谷氨酸脱氢酶法检测血清尿素氮（BUN）水平，采用改良苦味酸速率法检测血清肌酐（Cr）水平，采取免疫比浊法检测血清胱抑素C水平（CysC），采用ELISA法检测血清白介素 -1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)水平。

1.3.2 肾小管间质损伤指数评分 采用Paller法，对大鼠肾小管间质损伤程度进行评估。在光镜下，每个大鼠肾组织随机选取10个无重叠视野（放大倍数×200），观察肾小球以及肾小管间质细胞形态，通过病理专科医生采取盲法的原则，对病理观察结果进行评分，评分标准：肾小管明显扩张、细胞扁平，计1分；刷状缘损伤，计1分；脱落，计2分；管型，计2分；肾小管管腔内有脱落、坏死的细胞（未成管型或细胞碎片），计2分。得分越高，表示肾小管间质损伤越严重。

1.3.3 肾小管自噬体膜标志蛋白微管相关蛋白水平检测 采用 Western blot法检测 Tec、LC3-Ⅱ及Beclin-1的表达水平，将Western blot胶片扫描，通过凝胶成像处理系统，测定目的条带的光密度，以对应的β-actin蛋白条带为对照，计算Tec、LC3-Ⅱ及Beclin-1与β-actin蛋白积分光密度比值（ODI）。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0统计软件分析，计量资料以±s表示，行t检验；计数资料以例和百分率表示，行χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肾功能变化 与正常组相比，建模后1 h，模型组血Cr和BUN无明显变化，而血CysC已升高（P＜ 0.05）；建模后 24 h，血 Cr、BUN 及 CysC 水平均升高；建模后48 h，血Cr及BUN水平下降到接近正常范围，而血CysC水平仍明显高于正常组（P＜0.05）。 见表 1。

2.2 两组炎症因子水平及肾小管间质损伤程度变化 在建模后各时间点，模型组TNF-α、IL-1β水平均升高，其中TNF-α在建模后1 h即升高，之后显著降低，但48 h时仍明显高于正常对照组（P＜0.05)；IL-1β在建模后1 h即开始升高，24 h时达峰值，其后开始下降，但均明显高于对照组（P＜0.05)。模型组在建模后各个时间点肾小管间质损伤指数均明显升高（P＜0.05)，尤其在建模24 h时最为明显。见表2。

2.3 两组肾小管Tec激酶蛋白水平及自噬体膜标志蛋白比较 与正常组比较，模型组各个时间点Tec、LC3-Ⅱ及 Beclin-1水平均呈现先升高，后降低变化趋势，但均显著高于正常组（P＜0.05)。见表3。

表1 两组不同时间肾功能变化(n=16）

表2 两组炎症因子水平及肾小管间质损伤程度变化（n=16)

表4 两组肾小管Tec激酶蛋白水平及自噬体膜标志蛋白比较（n=16)

3 讨论

脓毒血症是一种临床上十分常见的能够导致患者全身多个脏器发生损伤的病理过程[7]，是由于感染而导致的全身性炎症反应综合征，严重者可导致患者死亡[8]。AKI是脓毒血症的常见并发症之一。TNF-α及IL-1β均是炎症因子，能够引发细胞因子风暴的发生，并放大机体的炎症级联反应。本研究发现，模型组在建模后 1、24、48 h 各时间点，TNF-α、IL-1β水平均明显升高，说明脓毒血症早期就可引起大量释放炎性因子，TNF-α及IL-1β参与了脓毒血症性AKI的发生、发展过程。

CysC是一类非糖基化的碱性小分子蛋白[9-10]，是反映肾脏功能的重要指标，CysC在肾功能正常时，由肾小球滤过，在近曲小管重吸收而被清除。本研究发现，与正常组比较，建模后1 h，模型组血BUN及Cr水平无明显变化，而血CysC已明显升高；建模后24 h，模型组血Cr、BUN及CysC水平均明显升高；建模后48 h，血Cr及BUN水平下降到接近正常范围，而血CysC水平仍明显高于正常组，表明建模后大鼠肾小球过滤功能及肾小管重吸收及分泌功能均损伤，且在脓毒血症的早期就存在肾脏损伤。

Tec激酶家族属于目前研究较多的热点蛋白。Tec非受体激酶与受体型蛋白酪氨酸不一样，其参与了信号转导，能够对多种关键信号传导路径进行调节[11]。国外研究发现，Tec家族在单核巨噬细胞的功能中具有十分关键的作用[12]，并可能与Toll样受体蛋白相互作用，通过免疫途径调节细胞的自噬和凋亡。脓毒血症性AKI的发病机制与肾小管上皮细胞的凋亡密切相关，而Tec非受体激酶是否通过免疫途径调节肾小管上皮细胞的自噬和凋亡，目前研究较少。本研究发现，与正常组相比，建模后各个时间点模型组肾小管细胞Tec非受体激酶蛋白水平明显升高，尤其24 h更为明显，48 h较前有所降低，但较正常组升高明显。这些结果与大鼠建模后肾功能相关指标的变化趋势大体一致，由此推测，Tec非受体激酶可能参与了脓毒血症性AKI的发生、发展，但具体的作用机制还需要更进一步研究分析。

LC3-Ⅱ及 Beclin-1均为自噬体膜标志蛋白，与细胞间自噬或凋亡相关。自噬与凋亡之间是一种十分复杂的交互调控，二者可以被很多应激刺激共同激活，甚至能够相互协调转化等。在本研究中，建模后各个时间点模型组自噬体膜标志蛋白表达LC3-Ⅱ及Beclin-1的蛋白表达均明显升高，尤其24 h时最为明显，48 h时虽有所降低，但较正常组仍升高明显，表明脓毒血症大鼠的自噬体膜标记蛋白水平上升，机体内自噬体数量上升，并有可能诱发细胞凋亡，这一现象与脓毒血症AKI的发病具有密不可分的关系[13]。

综上所述，Tec非受体激酶可能参与脓毒血症AKI的早期发病，并可能通过参与免疫途径调节细胞自噬和凋亡的机制而发挥作用。