MEF两种制备方法比较及接种密度的筛选

文│相荣科（山东省兰陵县畜牧局、北京农学院动物科学技术学院）

田兴福（山东省兰陵县畜牧局）

高建明 穆祥（北京农学院动物科学技术学院）

胚胎生物技术在畜牧生产、培育新品种和基础医学研究上具有重要的理论和商业价值。胚胎干细胞技术则是胚胎分割、胚胎克隆、体细胞克隆、胚胎嵌合、转基因动物生产等生物技术的枢纽。目前，胚胎干细胞技术已成为个体和器官发生发育、细胞分化和信号转导、新基因发现及其功能表达调控、肿瘤发生等研究领域不可或缺的模型材料和工具。同时，在细胞及基因治疗、转基因动物、药物开发等方面也显示了潜力。

胚胎干细胞（ESCs）是具有发育全能性的细胞。在进行ESCs、精原干细胞等特殊细胞的研究时，往往需要成纤维细胞作为饲养层，已达到干细胞维持生物学特性的条件。同时，ESCs不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，还对移植治疗、药物发现及筛选、细胞及基因治疗和生物发育等基础研究等带来深远的影响。本研究通过酶消化法结合组织块培养法培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），力求为胚胎干细胞的培养和传代提供方便、价廉、活性高、数量多、纯度高的饲养层细胞，从而获得量多、优质的ESCs，为以后深入的研究ESCs的分化提供优质和充足的材料。

本试验以12.5～14.5天的小鼠胚胎为材料，通过酶消化法结合组织块培养法分离培养MEF，对MEF生长状况进行观察并对MEF长满孔板的时间进行统计分析；获得的3～5代的MEF，以1×105/孔（低密度）、5×105/孔（中密度）、1×106/孔（高密度）不同密度接种，1天后观察饲养层细胞铺层情况；以购买的mESCs为材料，接种到不同密度的饲养层细胞上，观察mESCs的生长情况。结果表明：通过酶消化法可以较短时间获得原代MEF（2.18±0.19天），而组织块培养为5.13±0.24天，酶消化法结合组织块培养法可以获得更多MEF；1×105/孔密度饲养层铺层效果比较好，且mESCs生长状况良好。

一、材料和方法

1.试验材料。小鼠胚胎干细胞（mESCs）第3代。昆明白小鼠（SPF级，6～8周龄）购自北京实验动物中心。按公母鼠1∶2的比例晚上合笼，次日早7：00检查阴道栓。见栓日记为妊娠0.5天。选妊娠12.5～14.5天的孕鼠制备MEF。

2.主要试剂。孕马血清促性腺素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）、PBS（Gene Technology）、丝裂霉素-C、β-巯基乙醇、胎牛血清、0.25%Trypsin-EDTA消化液、特级胎牛血清。

3.培养液配制。MEF培养液：H-DMEM＋10% FBS＋100国际单位/毫升青霉素＋100微克/毫升链霉素。ESCs培养液：H-DMEM＋20% FBS＋0.1毫摩尔/升β-巯基乙醇（β-ME）＋2毫摩尔/升 L-谷氨酰胺＋100国际单位/毫升青霉素＋100微克/毫升链霉素＋1%非必需氨基酸＋10纳克/毫升白血病抑制因子（LIF）。

4.MEF饲养层的制备。酶消化法结合组织块培养法。

（1）酶消化法。取妊娠12.5～14.5天孕鼠脱臼法处死，75%的酒精浸泡5分钟，无菌环境中打开腹腔，分离出子宫，无Ca2+、Mg2+的PBS洗净血迹后，分离出胎儿和胎膜，洗净血迹，把胎儿从胎膜中分离出来。去除胎儿头、尾、四肢、内脏，无Ca2+、Mg2+的PBS洗涤后，将胎体剪碎成小于1立方毫米的组织块，以1毫升/支胎儿的量加入0.25%Trypsin-EDTA消化液浸泡组织块，37℃消化约5分钟，倒置显微镜下观察， 待较多细胞消化溢出后， 加入等量MEF培养液终止消化，轻微吹打，吸取上清液通过200目细胞筛后，以1000转/分钟离心5分钟获取细胞。调整细胞密度1×105个/摩尔，观察成纤维细胞的生长情况和长满时间。

（2）组织块培养法。组织消化后的残余组织块经含10%FBS的DMEM洗涤两次后分散置于培养板底部，每个组织块间距约5毫米，加入少量FBS，培养箱中培养2～4小时后，再加入适量MEF培养液，将组织块浸泡于培养基中。每3天换液一次，每天观察。

5.饲养层制备。MEF通过10微克/毫升的丝裂霉素C处理2小时，接种到0.1%明胶包被的孔板上。接种密度分别为1×105/孔（低密度）、5×105/孔（中密度）、1×106/孔（高密度），1天后观察细胞的铺层情况，之后接种ESCs并观察ESCs生长情况。

6.小鼠胚胎干细胞在饲养层上传代。

（1）mESCs的解冻。准备37℃温水，并把ESCs培养液预热到37℃，加入9毫升预热好的培养液添加到离心管中，把ESCs从液氮中取出，在3分钟内，37℃迅速解冻解冻存管中的细胞。待完全解冻后，对冻存管管壁进行消毒，把ESCs转移到盛有培养液的离心管中，注意不要产生气泡。用1毫升培养液冲洗冻存管，减少细胞损失，并转入离心管中，把悬浮液混匀，1000转/分钟离心5分钟，吸去上清液，加3毫升ESCs培养液，制成细胞悬液。把ESCs接种到预先明胶包被的孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养。第二天，换液，待细胞长到70%～80%融合时，可以进行传代处理。

（2）mESCs的传代。首先移去ESCs培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗3遍，洗去残留的培养液。用预热的37℃的0.25%Trypsin-EDTA消化液消化20秒后，加入等量的ESCs培养液吹打使终止消化。之后把消化液转移到离心管内，1000转/分钟离心5分钟。吸去上清液，加3毫升ESCs培养液，制成细胞悬液，把mESCs接种到预先明胶包被的孔板中。37℃、5%CO2培养箱中培养。第二天换液，待细胞长到70%～80%融合时，可以进行再次传代或冻存。

7.数据处理及分析。原代MEF长满时间，利用SPSS软件进行数据分析。

二、结果

1.不同方法培养MEF铺满孔板时间。酶消化培养MEF时，30分钟MEF即可贴壁。倒置显微镜下观察，MEF贴壁后。多有长短不等的数个突起，呈梭形、不规则三角形或扇形，核为卵圆形较大，细胞界限清晰，原代MEF2.18±0.1天即可长满孔板（图1A）。在原代时会有一些杂细胞，在第3代时，可得到较纯的MEF，生长连成片，细胞紧密排列无间隙。

表1 MEF铺满孔板时间

◎图1 不同培养方法MEF生长情况

◎图2 不同接种密度饲养层铺层情况

组织块培养法2～3天后可观察到大量细胞从组织块边缘游出，游出的细胞大多呈梭形，围绕组织块呈放射状排列（图1B）。5.13±0.24天后游出的细胞铺满孔板可传代培养（图1C）。

2.不同接种密度饲养层铺层情况。由图2可见，中等接种密度（图2B）的饲养层铺成单层效果比较好，较低接种密度（图2A）孔板内细胞空隙较大，未能形成饲养单层，较高接种密度（图2C）细胞排列较紧密。

3.mESCs在饲养层生长和传代。ESCs细胞解冻后置于孔板中可见细胞小亮圆边界清晰，胞浆少，细胞核大，核仁明显。细胞排列致密，呈克隆状生长（图3）。ESCs克隆周围平滑，倒置显微镜下观察有很强的立体感，克隆边界清晰、光滑，细胞排列紧密，细胞之间界限不清。随着培养天数的增加，细胞克隆进一步增大，中央逐渐突起，倒置显微镜下观察立体感更强，当细胞70%～80%融合时，需进行消化传代。

从ESCs在不同饲养层密度上生长状况来看，在较低密度饲养层上生长的ESCs形成的克隆小，克隆容易从板底脱落，很难达到克隆的融合；较高密度饲养层上生长的ESCs形成的克隆时间较长，达到融合时的时间也较长，且克隆中间部位细胞颜色加深，可能部分细胞已经老化；在中密度饲养层上生长的ESCs形成的克隆较快，克隆一旦形成，在1～2天既能达到融合。

ESCs消化后，按1∶2比例接种在MEF制作的饲养层上之后，约48小时即可出现典型的ES细胞克隆。克隆内细胞紧密地聚集在一起，细胞间界限不清，形似鸟窝，克隆周边与饲细胞层界限清楚，无分化迹象。ESCs克隆一旦出现，即可快速生长。表现为克隆逐渐增大，中央逐渐隆起。待细胞长到70%～80%融合时，可以进行再次传代或冻存。

三、讨论

1.不同方法培养MEF。ESCs培养普遍采用饲养层，它已形成一种常规且稳定的ESCs培养方式。目前用于制备饲养层的细胞主要有MEF、HEF（人胚胎成纤维细胞）、STO（SIM小鼠胚胎成纤维细胞）。其中MEF在ESCs建系、扩增培养中最为常用。目前制备MEF的方法有酶消化法、组织块贴壁法、酶消化法结合组织块法，但形成细胞单层的时间和数量不同。郎洪彦等用酶消化法制备的MEF的原代培养形成细胞单层所需时间为2.3±0.1天，组织块培养法制备的MEF形成细胞单层的时间为5.1±0.3天。

◎图3 解冻后3天呈克隆状生长的mESCs（100×，200×）

本试验通过将酶消化培养法和组织块培养法结合起来制备MEF，酶消化法制备的MEF的原代培养形成细胞单层所需时间为2.18±0.19天，组织块培养法制备的MEF形成细胞单层的时间为5.13±0.24天。与郎洪彦等研究没有显著差别。但该方法既可以在较短时间内获得大量MEF，从而在较短的时间内获得饲养层；又可以根据铺层时间上的差异，将一只母鼠制备的MEF分成两批，从而获得更多的MEF。

2.不同接种密度对MEF铺层的影响。ESCs在饲养层上的生长对饲养层细胞的密度要求较高。王璐等在研究中发现，饲养层细胞密度过高，在与ESCs竞争养分的同时细胞本身易老化，易发生卷层现象，将胚胎干细胞包裹其中，无法分离。饲养层细胞密度过低，分泌分化抑制因子不足，ESCs易发生分化。Vitezslav Bryja等指出，饲养层细胞密度过高时，可以增加换液频率；饲养层细胞密度过低时，可以补加饲养层细胞，以维持ESCs的培养条件。本试验以三种密度制备饲养层细胞时，发现中等密度制备饲养层细胞较合适。

3.mESCs在饲养层上生长状况。ESCs接种到饲养层细胞上之后，一般约24～48小时，最迟3～4天即可出现典型的ESCs克隆。细胞集落呈一典型的克隆状生长，呈长梭形或椭圆形，结构均匀，表面光滑，细

胞小，克隆内细胞紧密地聚集在一起，界限不清，形似鸟窝，细胞中有一个大的核，核内可见到1～2个核仁，胞质较少。克隆周边与饲养细胞层界限清楚，无分化迹象。ESCs克隆一旦出现，即可快速生长。表现为克隆逐渐增大，中央逐渐隆起。一般2～3天后饲养层上即可布满大量的克隆。本实验中观察到的ESCs的生长情况与文献中描述的相同，说明ESCs处于良好的生长状态。

四、结论

本试验通过酶消化培养法和组织块培养法结合起来制备MEF，不同接种密度制备饲养层，之后让ESCs在饲养层上生长，得出通过酶消化法可以较短时间获得MEF，酶消化法结合组织块培养法可以获得更多MEF；中等密度饲养层铺层效果比较好，且ESCs生长状况良好。