survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌组织中的表达及与胰腺癌患者临床特征的关系

赵甦，崔卫东，宋伟华

郑州大学第五附属医院肝胆胰腺外科，郑州 450052

胰腺癌的总体生存预后较差，流行病学研究显示，胰腺癌的病死率可达25%以上[1]。现阶段临床上胰腺癌的诊断水平较低，其早期筛查的灵敏度及特异度均不理想。肿瘤细胞生物学特征的改变是促进胰腺癌早期发生的重要因素。存活蛋白（survivin）能够通过影响肿瘤细胞的增殖速度和浸润能力，促进胰腺导管上皮细胞早期核异型性的发生，导致肿瘤细胞转移的风险增加[2-3]。胱天蛋白酶3（caspase 3）是凋亡相关因子家族成员，可以抑制肿瘤细胞程序性凋亡，促进肿瘤细胞增殖，提高G1/S期细胞比例[4-5]。有研究揭示了caspase 3和survivin在泌尿系统恶性肿瘤发生中的作用，认为高表达的caspase 3和survivin是促进肿瘤进展的重要因素[6]，但在胰腺癌中的研究不足。本研究采用免疫组织化学法分析caspase 3和survivin在胰腺癌组织中的表达情况，并分析其与胰腺癌患者临床特征的关系，旨在为胰腺癌的血清学诊断提供新的参考指标，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2012年3月至2017年3月于郑州大学第五附属医院行手术切除的胰腺癌患者的临床资料。纳入标准：①术前未合并其他部位恶性肿瘤；②术后病理证实为胰腺癌；③手术根治性切除肿瘤，术后生存期大于1个月，未发生围术期并发症；④有完整规范的术后病理报告及随访资料；⑤术前未接受放化疗。排除标准：①合并其他系统严重疾病者；②未能完成随访者；③合并贫血及凝血功能障碍者；④合并风湿及免疫系统疾病者；⑤合并严重的肝肾疾病者；⑥合并甲状腺功能障碍者；⑦因其他部位肿瘤进行过放化疗者。根据纳入和排除标准，本研究共纳入180例胰腺癌患者，收集患者的胰腺癌组织标本180例及对应的癌旁组织（距离病灶边缘3～5 cm）标本90例。180例胰腺癌患者中，男95例，女85例；年龄32～79岁，平均（60.1±13.2）岁；分化程度：高分化73例，中低分化107例；有淋巴结转移86例，无淋巴结转移94例；TNM分期：I期53例，Ⅱ期41例，Ⅲ期46例，Ⅳ期40例。

1.2 免疫组织化学染色法

所有组织标本均经石蜡包埋后作连续切片，厚度约为4 mm，采用链霉卵白素-生物素法染色，二氨基联苯胺（diamionben zidene，DAB）显色。survivin和caspase 3蛋白抗体、PV6000通用型二抗以及SP试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术开发公司。以阳性片和磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗分别作为阳性和阴性对照，高倍显微镜下观察survivin和caspase 3的表达情况，具体染色步骤严格按照SP试剂盒说明书进行操作。

1.3 免疫组织化学染色结果判定

每例标本在400倍光镜下随意选取10个视野，计数每个视野中100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均数计算阳性细胞所占百分比。根据染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞所占百分比≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分。根据染色强度评分与阳性细胞所占百分比评分之和判断免疫组织化学染色结果，0分为阴性（－），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中等阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。所有病理切片均由两位高年资病理医师进行单盲法评估。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件-对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织和癌旁组织中survivin、caspase 3蛋白阳性表达率的比较

survivin阳性颗粒呈棕色，主要位于细胞质及细胞核；caspase 3阳性颗粒呈淡黄色或棕黄色，主要位于细胞质（图1）。胰腺癌组织的survivin蛋白阳性表达率为86.67%（156/180），明显高于癌旁组织的 34.44%（31/90），差异有统计学意义（χ2=76.855，P＜0.01）（表 1）。胰腺癌组织的 caspase 3蛋白阳性表达率为88.33%（159/180），明显高于癌旁组织的36.67%（33/90），差异有统计学意义（χ2=77.966，P＜0.01）（表2）。

图1 survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达情况（免疫组化染色，×400）

表1 胰腺癌组织和癌旁组织中survivin蛋白的表达情况

表2 胰腺癌组织和癌旁组织中caspase 3蛋白的表达情况

2.2 胰腺癌组织中survivin和caspase 3蛋白表达与胰腺癌患者临床特征的关系

有淋巴结转移、中低分化胰腺癌患者胰腺癌组织的survivin蛋白阳性表达率均高于无淋巴结转移、高分化患者，差异均有统计学意义（χ2=5.758，P=0.016；χ2=5.532，P=0.019）；不同年龄、性别、TNM分期胰腺癌患者胰腺癌组织的survivin蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。高分化胰腺癌患者胰腺癌组织的caspase 3蛋白阳性表达率明显高于中低分化患者，差异有统计学意义（χ2=6.805，P=0.009）；不同年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移情况胰腺癌患者胰腺癌组织的caspase 3蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表 3）

表3 不同临床特征胰腺癌患者胰腺癌组织中survivin和caspase 3蛋白的表达情况（n=180）

3 讨论

胰腺癌的发病原因较为复杂，一般认为基因水平或者消化酶的波动可能是促进胰腺癌发生的主要原因。近年来越来越多的研究显示，基因调控或者分子生物学水平的改变是促进胰腺癌发生的又一重要因素。肿瘤相关蛋白能够影响肿瘤细胞的生物学特征，增强对肿瘤细胞细胞周期的调控，促进免疫逃逸，抑制机体的T淋巴细胞免疫反应，进而协助肿瘤浸润或转移[7]。血清学指标在恶性肿瘤特别是消化系统恶性肿瘤的早期筛查及临床预后评估中具有重要的参考价值，本研究的目的是为临床上胰腺癌的筛查提供新的研究靶点，并为胰腺癌患者的预后预测提供参考。

survivin蛋白作为核转录因子家族成员，包含了多个巯基蛋白结构，能够通过结合胰腺癌干细胞，促进干细胞对于邻近正常组织的浸润能力；同时survivin蛋白对Notch或AKT信号通路具有激活作用，导致移行上皮细胞核分裂象的异常，肿瘤细胞对基底膜层的突破作用明显增加[8-9]。caspase 3蛋白不仅可以影响胰腺癌细胞的凋亡水平，同时还能够促进肿瘤细胞的上皮间质转化，影响肿瘤细胞的细胞周期调控，或者在促进恶性肿瘤的免疫逃逸等方面发挥一定的作用[10-11]。

本研究结果显示，在胰腺癌患者的胰腺癌组织及癌旁组织中，均可以发现survivin和caspase 3蛋白的阳性表达，提示二者均可能参与胰腺癌的疾病进展，二者的阳性表达能够促进肿瘤细胞生物学特性的改变和上皮间质转化，影响基底膜的完整性，进而影响胰腺癌的发生过程。本研究结果显示，胰腺癌组织中survivin和caspase 3蛋白的阳性表达率均明显高于癌旁组织（P＜0.01），提示survivin和caspase 3蛋白可能在促进肿瘤细胞浸润的过程中发挥了重要作用。此外，本研究结果还显示，有淋巴结转移、中低分化胰腺癌患者胰腺癌组织的survivin蛋白阳性表达率均高于无淋巴结转移、高分化患者（P＜0.05），这主要考虑与survivin蛋白对于淋巴结内皮黏附分子adherin的表达调控作用有关，但具体机制仍需要后续研究的进一步探讨；高分化胰腺癌患者胰腺癌组织的caspase 3蛋白阳性表达率明显高于中低分化患者（P＜0.01），不同淋巴结转移情况胰腺癌患者胰腺癌组织的caspase 3蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示caspase 3蛋白不会影响肿瘤细胞的远处转移。同时还可以发现，不同TNM分期胰腺癌患者胰腺癌组织的survivin和caspase 3蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。分析原因可能是caspase 3和survivin蛋白主要影响胰腺癌的早期发生过程，而对于后续临床分期的进展可能影响不大。

综上所述，survivin和caspase 3蛋白在胰腺癌组织中高表达，并且与肿瘤的发生发展关系密切。