玉米紫色植株色素预干预对过氧化氢致成骨细胞氧化损伤的影响

张卓，周波，郭连莹，王晓红，于叶，张书婉

（沈阳医学院公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，辽宁 沈阳 110034）

近年研究显示，环境因素、某些生理及病理状态均可引起骨组织代谢异常，从而影响由成骨细胞和破骨细胞共同参与的骨重建过程，最终导致骨代谢紊乱［1-2］。氧化应激已成为多种慢性骨代谢性疾病发生发展的重要机制之一［1］。自然界中，天然抗氧化物种类繁多［3-4］，理论上来讲，适量摄入抗氧化剂在维持机体骨健康方面的作用是积极的。有研究证实，抗氧化活性物质在骨代谢疾病的防治过程中起到了一定的保护性作用［5-6］。

玉米紫色植株色素（maize purple plant pigment，MPPP）源于新品种玉米的紫色植株，其主要成分的结构鉴定结果显示，MPPP是花色苷类色素，总色素含量达90%以上，两种主要成分分别为矢车菊素-3-葡萄糖苷和3′，4′-二羟基花色素-3-葡萄糖苷［7］。研究发现，MPPP具有较强的抗氧化活性［8-9］和促进成骨细胞增殖的能力［10］。本研究以MC3T3-E1成骨细胞为体外干预模型，用过氧化氢（H2O2）制备氧化损伤模型，观察MPPP预干预条件下成骨细胞的抗氧化损伤作用，为后续研究提供基础科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 MPPP（辽宁省东亚种业有限公司）；H2O2（美国Sigma公司）；改良型α-MEM培养基（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胎牛血清（FBS）（天津灏洋生物制品科技有限公司）；MTT溶液（美国Sigma公司）；总抗氧化能力测试盒（T-AOC）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术公司）。

1.2 仪器与设备 BB-15型CO2培养箱（美国Heraeus公司）；Sonics超声波破碎仪（美国Sonics&Materials公司）；SpectraMax Plus 384全光谱扫描仪（美国MD公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 小鼠MC3T3-E1成骨细胞购于中国科学院上海生命科学研究所。将MC3T3-E1成骨细胞复苏后，置于改良型α-MEM培养基（含10%FBS）中，于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下培养，常规换液传代。

1.3.2 主要溶液配制 取0.5 g MPPP、0.1 ml H2O2分别溶解于10 ml含2%FBS的改良型α-MEM培养液中，过滤除菌，储备液浓度均为10-1mol/L。参考前期实验结果，将MPPP用相同培养液等倍稀释至 10-7、10-6及 10-5mol/L［10］；H2O2等倍稀释至10-10～10-3mol/L。上述溶液均现用现配。

1.3.3 成骨细胞氧化损伤模型的建立 调整细胞密度，接种于96孔板（每孔150μl），共设9组，每组8个复孔。48 h后，更换培养液150μl（含2%FBS），同步化24 h后，吸弃培养液，更换150 μl H2O2浓度分别为0 mol/L和10-10～10-3mol/L的培养液（含2%FBS），1 h后PBS清洗，向各孔中加入20μl MTT溶液（5 mg/ml），4 h后每孔更换150 μl二甲基亚砜（DMSO），37℃混匀10 min后，酶标仪490 nm检测光密度（OD）值，确定H2O2氧化损伤细胞的最佳浓度为5×10-4mol/L。

1.3.4 H2O2对MPPP预干预成骨细胞的影响 调整细胞密度，接种于96孔板（每孔150μl），共设3个批次，每个批次共5组，每组8个复孔，分组及处理因素如下：对照组、H2O2处理组（H2O2：5×10-4mol/L）、低浓度 MPPP组（MPPP：10-7mol/L+H2O2：5×10-4mol/L）、中浓度MPPP组（MPPP：10-6mol/L+H2O2：5×10-4mol/L）和高浓度 MPPP 组（MPPP：10-5mol/L+H2O2：5×10-4mol/L）。48 h后，每个批次中的对照组和H2O2处理组均更换150 μl培养液（含2%FBS），低、中、高浓度MPPP组分别更换MPPP浓度为10-7、10-6及10-5mol/L的培养液150μl（含2%FBS），3个批次分别继续培养24 h、48 h及72 h。每个批次于实验结束前5 h，吸弃各孔中培养液，对照组各孔更换培养液（含2%FBS），其余各孔更换浓度为5×10-4mol/L的H2O2液（含2%FBS），1 h后PBS清洗，向各孔中加入MTT溶液20 μl（5 mg/ml），4 h后每孔更换DMSO 150μl，37℃混匀10 min后，酶标仪490 nm检测OD值。

1.3.5 总抗氧化能力（T-AOC）检测 细胞消化，调整密度后接种于24孔板，每孔1 ml，继续培养72 h。吸弃培养液，加入含2%FBS培养液同步化24 h后，按照1.3.4中的分组方法添加受试物（MPPP预干预72 h），每组4个复孔，细胞消化，PBS清洗，转移至1.5 ml离心管中，4℃超声破碎，低温高速离心5 min，取上清液，按T-AOC试剂盒说明书进行操作，分别测定各组样品中蛋白含量和相对T-AOC。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，采用单因素方差分析行差异显著性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2对成骨细胞增殖的影响 与对照组（0 mol/L）比较，H2O2浓度范围从10-7mol/L至10-3mol/L的各组细胞OD值均显著降低（P＜0.01），其中以10-3mol/L浓度组细胞OD值最低，见图1。

2.2 H2O2对MPPP预干预的成骨细胞增殖和TAOC的影响 MPPP预干预24 h后，经H2O2处理的各组细胞OD值均显著低于对照组（P＜0.01），但低、中、高浓度MPPP组OD值与H2O2处理组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。MPPP预干预48 h和72 h后，H2O2处理组的OD值均显著低于对照组（P＜0.05）；预干预 72 h后，仅高浓度MPPP组细胞OD值显著高于H2O2处理组（P＜0.05）。此外，MPPP预干预72 h后，与对照组比较，H2O2处理组和低、中、高浓度MPPP组成骨细胞T-AOC显著降低（P＜0.01），且高浓度MPPP组成骨细胞T-AOC明显高于H2O2处理组（P＜0.01），见表1。

图1 H2O2对细胞增殖的影响（±s，n=8）

表1 H2O2对MPPP预干预成骨细胞增殖能力和T-AOC的影响（±s）

表1 H2O2对MPPP预干预成骨细胞增殖能力和T-AOC的影响（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与 H2O2处理组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01

组别对照组H2O2处理组低浓度MPPP组中浓度MPPP组高浓度MPPP组T-AOC（%）（n=4）100．00±5．84 31．21±4．852）36．01±8．162）36．42±15．872）60．78±10．702）4）OD值（n=8）预干预24 h 0．129 9±0．016 0 0．108 6±0．007 02）0．109 1±0．023 42）0．108 8±0．010 92）0．099 7±0．012 52）预干预48 h 0．126 1±0．015 9 0．110 8±0．010 61）0．113 3±0．010 2 0．116 5±0．013 1 0．115 3±0．012 8预干预72 h 0．134 6±0．009 9 0．110 7±0．011 31）0．119 0±0．022 5 0．124 1±0．019 1 0．133 7±0．028 13）

3 讨论

骨代谢过程主要由成骨细胞和破骨细胞共同完成。在正常生理条件下，骨形成和骨吸收始终保持动态收支平衡，骨重建维持稳态。一旦受到各种影响因素持续干扰，骨重建过程即可发生相对失衡，引发骨量异常，特别是氧化应激状态下，成骨细胞对活性氧极其敏感，其活性可受到明显抑制，成骨作用减弱，骨量逐渐减少，最终引发相应的骨代谢疾病［1］。体内外研究证实，外源性抗氧化剂在清除机体自由基的同时，亦可提升成骨细胞内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活力，从而减弱氧化应激状态下成骨细胞的氧化损伤［11-12］。

T-AOC水平不仅可以反映组织自由基清除能力，还可以作为反映酶类和非酶类抗氧化系统的一项综合性指标［13］。本研究发现，MPPP预干预条件下，可抑制来自H2O2对成骨细胞的氧化损伤，并维持较高水平的T-AOC，进而维持细胞活力，提示，MPPP可通过提升细胞抗氧化能力预防成骨细胞氧化损伤，维持骨健康。

另外，研究发现，花色苷可作为诱导物参与调控Nrf2信号通路［14］。Nrf2作为机体生物氧化应激调控的开关，处于调节抗氧化酶类表达的中心地位，在花色苷的诱导下，Nrf2游离释放，进入细胞核与抗氧化反应元件相互作用，促进抗氧化酶基因的转录，最终增强组织细胞的抗氧化能力［15］。只是，MPPP作为多种花色苷成分的复合物，其提升成骨细胞抗氧化能力的作用是否与Nrf2有关，且这种贡献在抗氧化作用中占有多大比例，尚需进一步探讨。总之，MPPP预干预可抑制H2O2对MC3T3-E1成骨细胞的氧化损伤并提升成骨细胞T-AOC。