天麻素干预对甲基苯丙胺染毒大鼠血清及脑海马组织TNF-α、IL-1β及BDNF含量的影响

陈晓雷，王琳，周天竹，杨秀丽，李新新

（1．沈阳医学院法医司法鉴定所，辽宁 沈阳 110034；2．沈阳二四五医院内科）

天麻素（4-羟甲基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷）为中药天麻的主要化学成分之一，具有促智、健脑、抗衰老的作用，临床用于神经衰弱、神经衰弱综合征及血管神经性头痛（如偏头痛、三叉神经痛、枕骨大神经痛等），亦可用于脑外伤性综合征等的治疗［1］。有关天麻素对依赖性药物引起脑组织损伤的干预及保护作用研究机制报道不一。本实验观察天麻素对甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）染毒大鼠脑海马组织炎症因子、脑源性神经营养因子（BDNF）含量的变化，探讨天麻素干预对MA染毒引起大鼠血清及脑组织损伤的保护作用，为天麻素用于依赖性药物的干预及治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 动物 健康雄性Wistar大鼠50只，体重（200±20）g，沈阳医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽）2012－0001。自由进食、饮水，适应性分笼饲养1周。

1．2 药品与试剂 MA（纯度90%，丹东市公安局提供）；天麻素注射液购自上海现代哈森（商丘）药业有限公司（国药准字H20166464）；肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒、白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒及BDNF试剂盒均购自上海基免实业有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1．3 方法

1．3．1 实验动物分组及MA慢性依赖动物模型制作 将Wistar大鼠随机分为空白对照组、MA模型组、MA+天麻素干预低剂量组（MA+50 mg/kg）、天麻干预高剂量组（MA+100 mg/kg）及天麻素药物对照组，每组10只。参照文献方法［2-3］，按照 0．5、1、2、8、10、15和20 mg/kg的剂量逐日递增腹腔注射MA，每天给药2次（8：00，20：00），从第8天开始维持20 mg/kg的剂量；在MA造模的同时，MA+天麻素（50、100 mg/kg）干预组每天1次腹腔注射天麻素（50 mg/kg、100 mg/kg），用以干预性治疗。连续染毒及给药10 d，自由进食、饮水。天麻素药物对照组每天一次腹腔注射天麻素100 mg/kg；空白对照组，每日腹腔注射相同体积的生理盐水。每天大鼠给药后1 h内进行行为学观察。

1．3．2 造模评估指标 大鼠刻板行为评分参照GHF-Dodd方法［3-4］进行评价。腹腔注射MA后每10 min评分一次。评分标准：0分，静止不动或几乎没有活动；1分，正常活动，偶尔有向前运动；2分，活动伴随反复向前探索；3分，继续向前探索；4分，重复抬头、摇头或旋转；5分，迅速摇头，旋转或摇头的背腹运动。以刻板行为评分≥2分以及刻板行为持续时间≥15 min，为造模成功。

1．3．3 取材与检测方法 于第11天用断头器快速断头，取血，分离血清；按文献［5］方法快速冰上分离脑海马组织，制备10%脑组织匀浆。采用ELISA法检测血清及脑海马组织TNF-α、IL-1β、BDNF含量，每一份样本进行双孔测定，严格按说明书进行操作。Bio-Rad680型酶标仪检测酶标板各孔OD值，计算各样本浓度。

1．4 统计学方法 采用SPSS 13．0软件进行统计学分析，实验数据均采用均数±标准差表示，采用t检验进行比较，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 刻板行为观察及评价 每组选取10只大鼠进行行为学观察。随着MA注射剂量逐渐增大，大鼠刻板行为表现增多，给予MA 2 mg/kg起，给药后约10 min左右，染毒大鼠出现偶尔向前运动、向前探索；重复抬头、摇头或旋转的背腹运动。易激惹、竖尾、撕扯腹部皮肤等自残行为。刻板行为约持续20～30 min缓解，而后出现嗜睡、精神萎靡、活动量下降，进食减少。随着给药时间的延长与给药次数的増多，刻板行为逐渐减少。MA+天麻素干预组（50、100 mg/kg）的大鼠会随着天麻素注射的増多而出现明显的嗜睡。

2．2 ELISA检测大鼠脑海马组织TNF-α、IL-1β、BDNF含量 与对照组比较，MA染毒模型组TNF-α、IL-1β含量均有显著增加，BDNF含量降低（P＜0．01）。与MA染毒模型组比较，MA+天麻素干预组（50 mg/kg）TNF-α含量降低（P＜0．05），BDNF含量增高（P＜0．01）；MA+天麻素干预组（100 mg/kg）TNF-α、IL-1β 含量均显著降低，BDNF含量显著增高（P＜0．01）。天麻素组与对照组比较差异无统计学意义，与MA染毒模型组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。见表1。

2．3 ELISA 检测大鼠血清 TNF-α、IL-1β、BDNF含量变化 与对照组比较，MA染毒模型组TNF-α、IL-1β含量增高，BDNF含量降低（P＜0．01）。与MA染毒模型组比较，MA+天麻素干预组（50 mg/kg）IL-1β含量降低（P＜0．05）；MA+天麻素干预组（100 mg/kg）TNF-α、IL-1β含量均显著降低，BDNF含量显著增高（P＜0．01）。天麻素组与对照组比较差异无统计学意义，与MA染毒模型组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。见表2。

表1 大鼠脑海马组织TNF-α、IL-1β、BDNF的表达水平比较（±s，n=10）

表1 大鼠脑海马组织TNF-α、IL-1β、BDNF的表达水平比较（±s，n=10）

注：与对照组比，1）P＜0．01；与 MA模型组比较，2）P＜0．05，3）P＜0．01

组别空白对照组MA模型组MA+天麻素干预低剂量组MA+天麻素干预高剂量组天麻素组BDNF（pg/mg）350.49±32.69 105.30±39.331）299.27±27.133）301.16±35.173）356.31±30.023）剂量（mg/kg）等量盐水50 100 100 TNF-α（pg/mg）113.52±58.09 231.99±48.411）182.72±37.062）144.46±46.193）109.81±40.273）IL-1β（pg/mg）108.97±51.21 374.06±43.851）333.92±51.72 262.29±81.683）112.38±38.193）

表2 大鼠血清TNF-α、IL-1β、BDNF的含量比较（±s，n=10）

表2 大鼠血清TNF-α、IL-1β、BDNF的含量比较（±s，n=10）

注：与对照组比较，1）P＜0．01；与MA模型组比较，2）P＜0．05，3）P＜0．01

组别空白对照组MA模型组MA+天麻素低剂量干预组MA+天麻素高剂量干预组天麻素组BDNF（pg/ml）125.26±28.03 82.65±23.221）98.58±32.71 103.91±35.363）120.13±26.013）剂量(mg/kg)等量盐水50 100 100 TNF-α（pg/ml）146.91±30.29 228.29±44.111）202.94±31.04 196.71±58.763）140.53±31.023）IL-1β（pg/ml）41.74±21.77 95.61±42.631）87.65±37.572）62.99±26.293）50.07±21.183）

3 讨论

MA属于苯丙胺类兴奋剂，具有较强的神经毒性，长期滥用因慢性中毒而出现体质下降，认知功能障碍及各种精神障碍，出现幻听、幻视，甚至是精神分裂症样症状或严重抑郁症状。MA引起的神经毒性有多种机制，主要包括神经元凋亡、谷氨酸介导的兴奋性毒性、氧化应激、细胞因子的形成、线粒体功能紊乱及神经胶质细胞的活化等［6］。

MA滥用引起的脑神经损伤可能与小胶质细胞过度激活有关。在毒品滥用、外伤和多种神经退行性脑病死亡者的尸检中，发现脑内有激活的小胶质细胞、星形胶质细胞及一系列免疫反应产物的高表达，如TNF-α、IL-1、IL-6及补体等，而正常人无此反应［7］。在动物模型中MA中毒导致的记忆损伤、学习障碍，是通过小胶质细胞激活反应和肿瘤坏死因子系统作用在海马神经元，导致海马神经元功能障碍引起的［8］。小胶质细胞在中枢神经系统损伤后是最早发生反应的细胞，它不停地清除着中枢神经系统中损坏的神经及感染性物质，是中枢神经系统中的第一道免疫防线。中枢神经系统损伤可激活小胶质细胞，在神经系统损害发生发展的过程中过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性，活化的小胶质细胞产生大量兴奋性神经毒性氨基酸，合成、释放多种细胞因子（如IL-1、一氧化氮等），介导细胞炎症反应引起炎症损伤，通过启动中枢神经系统免疫应答，过度的免疫反应、补体激活、抗体依赖的细胞毒等杀伤、吞噬作用对中枢神经系统均具有损害作用［9］。

TNF-α在正常脑组织中水平极低，当脑组织损伤时，由星形细胞、小胶质细胞及血管内皮细胞等释放。TNF-α是具有多种生物效应的细胞因子，是中枢神经系统参与免疫应答和炎症级联反应的重要介质，发动并且维持中枢神经系统的炎性反应过程，通过和细胞膜上的特异性的受体结合，诱导肿瘤细胞及神经细胞等多种正常细胞凋亡及炎症性疾病等病理过程［10］。过度激活的小胶质细胞能大量分泌IL-1β，IL-1β含量的升高会刺激其他的炎性细胞因子的表达，从而对神经组织造成损伤。

BDNF是哺乳动物脑组织中浓度最高的神经营养因子，在海马、大脑皮层表达最为活跃，对学习、记忆和高级思维有重要作用，对于神经元的生长、分化、存活、可塑性及损伤后的修复具有重要作用。BDNF与酪氨酸激酶受体结合后，激活膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传递途径，依次激活胞质内、核内相关信号蛋白，激活整个信号传递系统从而发挥功能作用。BDNF可调节多巴胺与五羟色胺的含量，促使多巴胺能神经生长，具有对抗MA毒性的作用，BDNF通过増强细胞内抗氧化物质的活性，使神经细胞产生的自由基被分解，实现对损伤神经细胞的修复［11］。

天麻素（gastrodin）是传统中草药天麻的有效活性成分之一，对中枢神经系统、心血管系统及免疫系统都有着广泛的药理作用，能扩张脑血管、增加脑血流量、提高脑细胞的抗缺氧及损伤能力，天麻素可通过抗氧化损伤、抗炎症损伤、抗细胞凋亡三个方面发挥脑损伤治疗作用［12］。本实验研究结果发现MA依赖模型大鼠血清及脑海马组织IL-1β、TNF-α含量明显升高，MA依赖大鼠表现出明显的刻板行为，在给予天麻素干预治疗后MA依赖大鼠血清及脑海马组织IL-1β、TNF-α含量呈明显降低趋势，MA依赖大鼠的刻板行为减少。炎症细胞因子作为人体重要的炎症介质，参与脑损伤后多种病理生理过程，炎性反应与MA依赖者机体的神经免疫系统功能紊乱有密切关系。本实验结果显示天麻素以其抗氧化、抗炎效应，降低炎症因子水平，减少MA对依赖大鼠海马神经元的损伤。

BDNF对神经元有营养和修复作用，其机制主要通过激活星形胶质细胞内源性抗氧化系统Nrf2/ARE信号通路，减少氧化损伤，发挥神经保护作用［13］。本研究结果发现，MA依赖模型大鼠血清及脑海马组织BDNF含量降低，天麻素干预后使MA依赖大鼠血清及脑组织BDNF含量升高，本实验结果表明天麻素增强了MA依赖者神经元损伤后的修复作用。

MA对神经系统的损伤机制十分复杂，天麻素对MA依赖大鼠脑神经损伤的干预和保护是通过哪些途径和机制实现的还有待于进一步系统研究。