高效液相色谱法测定复方银杏通脉口服液中总黄酮醇苷含量*

张 耕，刘 译，唐 勇，杨跃龙

（湖南省怀化市食品药品检验所，湖南 怀化 418000）

复方银杏通脉口服液主要由银杏叶、（制）何首乌、女贞子、丹参、杜仲、川牛膝、钩藤7种中药组方，具有滋阴补肾、舒肝通脉功效，临床主要用于治疗中老年人轻度脑动脉硬化所致头晕头痛、耳鸣耳聋、视物模糊、记忆力减退、腰膝酸软、肢体麻木等。复方银杏通脉口服液现行国家药品标准中，只对制何首乌有液相含量定量测定，而银杏叶检验只有银杏叶对照药材薄层色谱定性鉴别，没有银杏叶相关液相含量定量测定。现有研究表明，银杏叶主要有效活性成分为总黄酮醇苷（槲皮素、山柰素与异鼠李素）和萜类内酯，总黄酮醇苷具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊调脂等功效。有关银杏总黄酮醇苷的研究报道［1-16］较多，为了更有效地控制产品质量，本研究中参照 2015 年版《中国药典（一部）》［17］银杏叶总黄酮醇苷含量测定项相关方法，对复方银杏通脉口服液中总黄酮醇苷采用高效液相色谱（HPLC）法进行定量分析，以完善该制剂现行质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪（包括LC-20AT四元泵，SPD-M20A紫外检测器，SIL-20A自动进样器，LCsolution色谱工作站，日本岛津公司）；HH-6型数显恒温水浴锅（温度控制范围0．0～100．0℃，常州智博瑞仪器制造有限公司）；XSE105DU型十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Direct-Q3型纯水机（美国密理博公司）。

1．2 试药

槲皮素对照品（纯度为98．1%，批号为100081-201509），山柰素对照品（纯度为 93．2% ，批号为110861-201310），异鼠李素对照品（纯度为 100．0%，批号为110860-200608），均由中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用；复方银杏通脉口服液（规格为每瓶 1 mL，批号分别为 20160305，20160306，20160401，湖南补天药业有限公司）；阴性样品（规格为每瓶10 mL，批号为20160127，湖南补天药业有限公司）；甲醇（色谱纯，批号为 I0887507 717，Merck KgaA公司）；磷酸（色谱纯，批号为20170801001，天津赛孚瑞科技有限公司）；盐酸（优级纯，批号为20161128，国药集团化学试剂有限公司）；水为Millipore Direct-Q3型纯水机制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Shimadzu C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0．4%磷酸溶液（55∶45）；流速：1．0mL／min；柱温：25 ℃；检测波长：360 nm；进样量：10 μL。理论板数按槲皮素峰计应不低于2 500，分离度按山柰素与异鼠李素峰计算应大于1．5。

2．2 溶液制备

对照品溶液：分别称取槲皮素、山柰素与异鼠李素对照品 20．20，21．41，10．60 mg，精密称定，置 100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取15 mL，置200 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含槲皮素、山柰素与异鼠李素对照品分别为 14．86，14．96，7．95 μg 的混合对照品溶液。

供试品溶液：取装量差异项下的本品，混合均匀，精密量取10 mL，加甲醇 16 mL，18%盐酸8．0 mL，置沸水浴中加热回流90 min后，自然冷却至室温，移至50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，用0．45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，作为供试品溶液。

阴性对照品溶液：取阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2．2项下3种溶液各10 μL，按拟订色谱条件注入色谱仪，测定。结果阴性对照品溶液色谱中，在与供试品溶液相同保留时间处无色谱峰出现，表明阴性对照无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取含槲皮素、山柰素与异鼠李素的混合对照品溶液各10 μL，质量浓度分别为（1．48，1．49，0．79），（1．98，1．99，1．06），（3．96，3．99，2．12），（5．94，5．98，3．18），（7．92，7．98，4．24），（9．90，9．97，5．30），（14．86，14．96，7．95）μg ／mL，进样 10 μL，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n＝7）

精密度试验：精密吸取同一含槲皮素、山柰素与异鼠李素对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件连续进样6次。结果峰面积平均值槲皮素为207 448．2，山柰素为191 774．5，异鼠李素为 71 797，RSD分别为 0．75% ，0．38%，0．81%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20160401）样品，依法制备供试品溶液，分别于 0，1，2，4，8，12 h 时进样10 μL，记录峰面积。结果峰面积的平均值槲皮素为221 367．8，山柰素为 205 558，异鼠李素为 78 177，RSD分别为 0．43% ，0．47% ，0．98% （n＝6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20160401）样品，依法平行制备供试品溶液6份，按拟订色谱条件分别进样10 μL测定。结果峰面积的平均值槲皮素为201 601，山柰素为190 075．5，异鼠李素为71 065，RSD分别为0．76%，1．35%，1．44%（n＝6），表明方法重复性良好。

定量限检测：称取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品，精密称定，配成每 1 mL 各含 0．150，0．150，0．075 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色谱仪。结果表明，信噪比（S／N）≈10时，槲皮素、山柰素、异鼠李素的定量限分别为 0．003 0，0．003 0，0．001 5 μg。

加样回收试验：分别精密量取6份已知含量的样品（批号为 20160401，质量浓度为槲皮素 25．70 μg ／mL、山柰素 22．75 μg ／mL、异鼠李素 9．78 μg ／mL）溶液7 mL，分别精密加入混合对照品溶液（质量浓度为槲皮素 49．54 μg／mL、山 柰 素 49．88 μg ／mL、异 鼠 李 素26．50 μg ／mL）3 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，进样测定，计算回收率。结果见表2至表4。

2．4 样品含量测定

按外标法以峰面积分别计算槲皮素、山柰素与异鼠李素的含量，以下列公式换算成总黄酮醇苷的含量：总黄酮醇苷含量＝（槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量）×2．51。结果见表 5。

表2 槲皮素加样回收试验结果（n＝6）

表3 山柰素加样回收试验结果（n＝6）

表4 异鼠李素加样回收试验结果（n＝6）

表5 样品中总黄酮醇苷的含量测定结果（μg／mL，n＝3）

3 讨论

3．1 水浴温度及回流时间选择

试验表明，水浴温度及回流时间对酸水解结果影响较大。取同一批样品（批号为20160401）测定，当水浴温度为85℃、回流时间为45 min，测得总黄酮醇苷含量为108．43 μg ／mL；85 ℃ ，60 min，含量为 117．84 μg ／mL；90 ℃，60 min，含量为 135．85 μg／mL；90 ℃，90 min，含量为 141．27μg／mL；100℃，90min，含量为 144．65μg／mL；100 ℃ ，105 min，含量为 142．39 μg ／mL。最终选择总黄酮测得含量最高的条件（即100℃水浴中加热回流90 min）对样品进行酸水解。

3．2 流动相选择

曾采用2015年版《中国药典（一部）》银杏叶中总黄酮醇苷含量测定方法中采用的流动相条件，即甲醇-0．4%磷酸溶液（50∶50），对样品进行测定，但山柰素峰与异鼠李素峰分离效果不理想。采用2．1项下流动相条件，即甲醇 -0．4%磷酸溶液（55 ∶45），很好地解决了山柰素峰与异鼠李素峰分离度的问题（＞1．5），符合色谱系统适用性条件要求，可用于本制剂中总黄酮醇苷含量测定。

3．3 方法适用性

本试验中建立了复方银杏通脉口服液中总黄酮醇苷的含量测定方法，以槲皮素、山柰素和异鼠李素为对照品，采用HPLC法测定，方法简单、结果准确、数据重复性、精密度都良好，方法专属性较强，适用于复方银杏通脉口服液的质量控制。