苗药云实皮超高效液相色谱指纹图谱研究*
2018-10-25何燕玲姚成芬谭安菊李勇军
骆 勇 ，何燕玲 ，姚成芬 ，马 雪 ，杨 畅 ，谭安菊 3，，李勇军 △
（1．贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004； 2．贵州医科大学·民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004； 3．贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004； 4．贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004）
云实皮为豆科植物云实Caesalpinia decapetala（Roxb．）Alston 的干燥根或根皮，俗名阎王刺（贵州）、雷公刺、刺木草等，分布于我国贵州、广东、海南等地［1-2］。其收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，为贵州省民间常用药材，民间使用较广泛，苗药“云实感冒合剂”“马兰感寒胶囊”等均含有该药材。其具有祛风除湿、解毒消肿的功效，可用于治疗感冒发热、咳嗽、咽喉肿痛、牙痛等症［3］。云实主要含萜类和黄酮类化学成分，有良好的抗疟疾活性及抗病毒等生物活性［4-7］。前期研究对云实皮抗炎作用活性部位的化学成分进行了研究［8］，并选用活性部位含量较高且具有代表性和专属性的二氢红花菜豆酸苷和（±）原苏木素B为对照品，对云实皮药材进行了含量测定［9］。为从整体上控制药材的质量和确保药材的一致性，在前期研究基础上，本研究中建立了云实皮药材的指纹图谱测定方法，确定了14个共有峰，并鉴定了其中2个峰，为进一步提高云实皮药材的质量控制提供了试验基础。
1 仪器与试药
1．1 仪器
Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪（包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 2工作站）；AE240型电子天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司）；TDL80-2B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）。
1．2 试药
（±）原苏木素B对照品，二氢红花菜豆酸苷对照品（本实验室自制并鉴定，HPLC面积归一化法计算，纯度＞98%）；乙腈和甲酸为色谱纯，甲醇为分析纯，水为纯净水。32批云实皮药材采收于贵州省各地（见表1），由贵州医科大学药用植物与生药学教研室龙庆德副教授鉴定为豆科植物云实Caesalpinia decapetala（Roxb．）Alston的干燥根茎。
表1 32批云实皮样品来源
2 方法与结果
2．1 色谱条件
色谱柱：AcquityUPLCBEHC18柱（150mm×2．1mm，1．7 μm）；流动相：乙腈（A）-0．1% 甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～12 min，5%A；12～30 min，5% ～14%A；30～32 min，14% ～20%A）；流速：0．3 mL ／min；柱温：45 ℃；检测波长：266 nm；进样量：1 μL。
2．2 溶液制备
对照品溶液：分别称取（±）原苏木素B、二氢红花菜豆酸苷适量，精密称定，用50%甲醇配制成质量浓度分别为 2．400 mg／mL 和 0．796 mg／mL 的混合对照品溶液。
供试品溶液：称取云实皮粉末（过40目筛）约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇25 mL，称定质量，加热回流提取2 h，置室温，用70%乙醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，以10 000 r／min的速率离心10 min，取上清液，即得。
2．3 方法学考察
精密度试验：取同一批云实皮样品，按2．2项下方法制备供试品溶液，按2．1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，采用国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版）”计算相似度。结果均大于0．99，表明仪器精密度良好。
图1 32批云实皮超高效液相色谱指纹图谱及对照指纹图谱
重复性试验：取同一批云实皮样品，依法平行制备供试品溶液6份，依法测定，记录色谱图，同法计算相似度。结果均大于0．99，表明方法重复性良好。
稳定性试验：取同一批云实皮样品，依法制备供试品溶液，分别于 2，4，8，12，24 h 时按相同色谱条件进样测定，记录色谱图，同法计算相似度。结果均大于0．99，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2．4 指纹图谱的建立及相似度计算
2．4．1 指纹图谱的建立
取32批云实皮药材，依法分别制备供试品溶液，以相同色谱条件进样检测，依法评价相似度，利用中位数法进行自动匹配生成对照图谱R。详见图1。
2．4．2 指纹图谱的相似度评价
采用同一系统分析了32批不同产地云实皮药材的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果见表2。可见，指纹图谱相似度除贵阳药用植物园2批药材（编号为S1 和 S3）低于 0．5，贵州从江 1 批药材（编号为 S30）低于0．8外，其余批次均在0．860～1．000之间，说明贵州产云实皮药材含有的化学成分较一致。
表2 32批药材指纹图谱相似度评价结果
2．4．3 共有峰的指认
通过比较32批云实皮药材的指纹图谱，确定了14个共有峰。通过与混合对照品溶液色谱图的比对，指认出2个峰，其中9号峰为二氢红花菜豆酸苷，10号峰为（±）原苏木素B。详见图2。
3 讨论
图2 云实皮指纹图谱
本试验中测定了贵州32批云实皮药材的UPLC指纹图谱，确定了14个共有峰，并通过对照品指认了二氢红花菜豆酸苷和（±）原苏木素B 2个主要特征峰。总体来看，各批药材整体峰形相似，而峰面积存在一定差异。除贵阳药用植物园2批和从江1批药材相似度小于0．800外，其余指纹图谱的相似度均较高，说明贵州不同产地云实皮药材整体化学成分组成差异较小，含量有一定差异，这与云实的生长环境、采收时间，云实皮的加工处理及贮藏方法有关。方法学考察结果表明，本试验中建立的UPLC法操作简便，所建立的指纹图谱峰分离度、精密度、稳定性、重复性均好，可用于控制云实皮药材的质量一致性。
