葛根中葛根素与大豆苷元超声提取工艺研究

崔 颖 ，刘馨湄 ，才 凤

（1．辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034； 2．辽宁省食品检验检测院，辽宁 沈阳 110015）

葛根为豆科野葛Pueraeia lobata（Willd．）Ohwi或甘葛藤Pueraeia thomsoniiBenth．的干燥根，为临床常用中药，《本草纲目》载其性凉、气平、味甘，具清热、降火、排毒功效。民间用葛根退热生津。葛根含12%的黄酮类化合物，如葛根素、大豆黄酮苷、花生素等营养成分，还含有蛋白质、氨基酸、糖和人体必需的铁、钙、铜、硒等矿物质，是老少皆宜的名贵滋补品，有“千年人参”之美誉［1-2］。传统的提取方法有冷浸法、加热回流法、水煎煮法、渗漉法等［3-10］，但其提取速度慢、耗能，无法充分利用葛根活性物质，造成资源浪费。本试验中采用低温超声裂解法破碎细胞，加速有效成分进入溶剂，缩短提取时间，减少高温对提出成分的影响，并将有效物质释放出来，以最大限度地提高利用率。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

LGJ-12型冷冻干燥机（北京松源华兴科技有限公司）；RE-2000E型旋转蒸发仪（河南巩义市予华仪器有限公司）；BS224S型分析天平（德国赛多利斯仪器公司）；JY98-ⅢDN型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LC-10P型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1．2 试药

葛根药材（亳州春雷药材有限公司）；葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为752-200508）；大豆苷元对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110752-200511）。所用试剂均为分析纯，供试液均按2010年版《中国药典》附录配制。

2 方法与结果

2．1 药材鉴定

葛根为豆科野葛Pueraeia lobata（Willd．）Ohwi或甘葛藤Pueraeia thomsoniiBenth．的干燥根，经辽宁省中医药研究院主任药师刘景文鉴定，符合2010年《中国药典（一部）》［11］葛根项下有关规定。

2．2 葛根素及大豆苷元含量测定

2．2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Spherigel C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水，梯度洗脱（梯度洗脱条件见表1）；检测波长：250 nm；流速：1．0 mL ／min；进样量：10 mL；柱温：30℃。理论板数按葛根素峰计不低于4000。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱条件

图1 高效液相色谱图

2．2．2 溶液制备

精密称取葛根素对照品和大豆苷元对照品适量，加甲醇溶解并定容至刻度，制得每1 mL含葛根素8 μg和大豆苷元10 μg的混合溶液，作为对照品溶液。

取本品粉末（过 3号筛）0．1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声处理15 min，放冷，称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，0．45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2．2．3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取对照品溶液3，5，10，15，20 μL 进样，按 2．2．1 项下色谱条件测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得葛根素回归方程Y＝37 700 889X+7 451，R＝0．9997（n＝5），进样量线性范围为0．024～0．160μg；大豆苷元回归方程为Y＝674 583X-403．6，R＝0．999 7（n＝5），进样量线性范围为 0．03 ～0．20 μg。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液20 μL，连续进样 6次。结果的RSD为0．76% （n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h 时进样，测定峰面积。结果葛根素和大豆苷元峰的RSD分别为 1．00% 和 1．10% （n＝6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验：精密称取6份样品，依法制得供试品溶液，进样测定。结果葛根素和大豆苷元峰面积的RSD分别为0．80%和0．90%（n＝6），表明方法重复性良好。

回收率试验：称取已知含量供试品粉末6份，每份0．05 g，精密称定，加葛根素对照品 0．18 mg，大豆苷元对照品 0．25 mg，按 2．2．1项下色谱条件测定并计算。结果葛根素和大豆苷元的回收率分别为99．87%和100．32%，RSD分别为 0．70%和 1．80% （n＝6）。

2．2．4 样品含量测定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，结果葛根素含量为40 mg／g，大豆苷元含量为 1．06 mg ／g。

2．3 提取工艺正交试验

取野葛药材300 g，破碎备用。根据野葛中葛根素的理化性质，以水作为溶剂进行超声提取，按L9（34）表进行正交试验，采用高效液相色谱法［12-14］，以葛根素、大豆苷元为考察指标，以加水量（因素A）、提取时间（min）（因素B）、提取次数（因素C）为考察因素，优选葛根超声提取最佳工艺。因素水平表见表2，试验结果见表3，方差分析结果见表4。影响水提效果的因素顺序为A＞C ＞ B。查表得F0．05（2．2）＝ 19．00，F0．01（2．2）＝ 99．00，方差分析结果表明，因素A、因素B、因素C具有显著性意义，表明本试验设计较有意义。结合R水平，得出葛根素、大豆苷元最佳提取工艺为A1B3C3，即加8倍量水，每次提取30 min，提取3次。

表2 因素水平表

表4 方差分析表

2．4 验证试验

称取药材5份，精密称定，按最佳提取条件进行提取、浓缩，分别测定葛根素、大豆苷元总量。结果见表5。得出的数据与正交试验直观分析得出的结论相吻合，本试验中确定的水提工艺可行、稳定、合理。

表5 最佳工艺验证试验结果

2．5 葛根收率

将2．4项下的5份提取液合并，经旋转蒸发仪适当浓缩，利用冷冻干燥技术［15］进行干燥，温度为-60℃，预冻4 h，然后在程序升温曲线条件下干燥28 h，即得。计算葛根的收率为52．4%，程序升温曲线见图2。

图2 葛根的程序升温曲线

3 讨论

通过单因素和正交试验，优化了超声提取的工艺条件，确定最佳提取工艺为加8倍量水，提取3次，每次提取30 min。该试验以水溶液为提取剂，成本低廉，工艺操作简单，且提取过程中未加入任何有毒物质，因此安全性较高，适于工业化生产。

关于葛根药材成分提取的研究报道很多，提取过程中影响因素很多，优化时所考虑的影响因素不同，各因素水平也不相同，同时各因素间又相互影响，因而在提取过程中要综合考虑各种因素，以保证最佳提取工艺优化的确定性。结合文献研究和预试验，本研究中以水为提取溶剂，并以低温超声的提取方式进行提取，以葛根主要化学成分和活性成分葛根素、大豆苷元的含量作为考察指标，专属性强，并采用正交试验，确定最佳提取工艺。优选的工艺简单、稳定、可行，可控性良好。本研究中采用低温冷冻干燥技术对葛根提取物进行干燥，不但脱水较彻底，且干燥后的多肽成分性质稳定，便于长时间贮存，能更好地控制温度，保护活性成分。