Kisspeptin 1基因单核苷酸多态性与生长激素缺乏性侏儒症的相关性研究

姜书琴，王 伟，陆文全，罗向阳

生长激素缺乏性侏儒症（growth hormone deficiency dwarfism，GHDD）是由于腺垂体合成和分泌生长激素部分或完全缺乏，或由于生长激素分子结构异常等所致的生长发育障碍性疾病。其发病机制涉及激素、环境、遗传等多方面，其中遗传约占 75%［1］。 Kisspeptin 1（Kiss－1）基因（肿瘤转移抑制基因），主要依靠Kp/GPR54系统对机体起调控作用［2］，有研究发现 kiss－1 基因可以调控生长激素（GH）的分泌，其多态性改变与身高存在一定的相关性［3］。迄今为止，全基因组关联研究（genome wide association study，GWAS）已经发现人类的身高至少与180个基因位点有关，可以解释10%的身高变异［4］，基于 GWAS 研究结果，选取 Kiss－1 基因的 C.－89（rs3924587）及 c.－145（rs5780218）共 2 个单核苷酸多态性（SNPs）位点，探讨河南地区GHDD患者与Kiss－1基因单核苷酸多态性的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 （1）GHDD组。随机选取2017年07月—2017年11月在郑州大学第三附属医院儿科内分泌中心就诊的GHDD患者60例 （其中男30例，女 30 例），平均年龄（7.4±1.4）岁。 纳入标准：①身高落后于同年龄、同性别正常健康儿童身高的第3 百分位数｛减 1.88 个标准差（－1.88）｝或减 2 个标准差 （－2 s以下）（参照2005年中国儿童身高标准）；②年生长速率＜5 cm/年；③匀称性矮小，面容幼稚；④无慢性器质性疾病、染色体异常等；⑤骨龄落后于实际年龄；⑥两种GH药物激发实验GH峰值均＜10μg/L； ⑦性成熟分级 （sexual maturityrating，SMR），也称为Tanner分期，为1期：女孩乳房为幼儿型，男孩睾丸直径＜2.5 cm（超声测量）及 Prader睾丸计测定的睾丸容积1～3 ml，患者均无阴毛发育。（2）对照组。随机选取同期在郑州大学第三附属医院体检的同年龄同性别青春期前健康儿童60例（其中男 30 例，女 30 例），平均年龄（7.4±1.4）岁。纳入标准：①身高在同年龄同性别正常人的±1SD之间；②无内分泌代谢及慢性器质性疾病。该研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象及其家属均签署知情同意书。（3）检测指标。GHDD组患者需定期监测身高、体重、肝肾功能、甲状腺功能、血糖、血清IGF－1水平及骨龄。（以上操作由经过培训的专业人员操作，生化指标采用化学发光方法进行）

1.2 实验方法 （1）采集标本。于早晨空腹收集所有研究对象外周静脉血2 ml，放入含EDTA的真空采血管中，－80℃冰箱保存备用。（2）遗传分析。使用全血 DNA 提取试剂盒（Kurabo，Osaka，Japan）提取所有研究样本的基因组DNA，对DNA浓度及纯度进行检测后－20℃冰箱保存备用。使用南京金斯瑞生物科技公司设计合成的引物进行目的片段的PCR扩增。引物序列如下：

引物rs3924538

F：GGCCTGTGCTTGGAGACGTCAC

R：GTGTGCCAGTCTTAGATTTCCACCA

引物rs5780218

F：GTGTTGCAAAGCCATCTTTC

R：TCTTTTATTGCCTCGGGTTG

PCR 扩增总为 50μl，包括 12μl灭菌水、25μl 2×PCR Buffer for KOD、5μl 2mM dNTPs、2μl 25mM MgSO4、 引物各 1μl （10μM each）、3μl模板、1μl KOD （1 U/μl）。 PCR 设定的条件为：94℃预变性2 min，98℃变性 10 s，55℃退火 30 s，68℃延伸 60 s，共35个循环，PCR产物4℃保存。

在琼脂糖凝胶电泳上分离纯化PCR产物，随后采用 3730xl毛细管测序仪 （Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）进行测序。基因型分析使用Genemapper软件（v.4.0；Applied Biosystems）。

1.3 统计学处理 利用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计数资料以例数和%表示，采用χ2检验比较GHDD组与对照组基因型分布及等位基因频率差异；采用拟合优度χ2检验进行遗传平衡检验，P＞0.05 认为基因型分布符合 Hardy－Weinberg 平衡。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg（HWE）平衡 比较 GHDD组与对照组rs3924587及rs5780218位点基因型的理论值与实际值，结果显示 P＞0.05，符合 HWE，该研究样本的群体代表性较好。见表1。

表1 两组rs3924587及rs5780218位点基因型理论值与实际值比较

2.2 两组kiss-1基因SNPs位点基因型及等位基因频率比较 （1）rs5780218位点基因型分布频数：GHDD 组 T/T、C/T、C/C 分布频数分别为 17、22、21例；对照组T/T及C/T、C/C分布频数分别为19、20、21 例。 两组在基因型构成比（χ2=2.412，P=0.120）和等位基因频率（χ2=2.340，P=0.126）上差异均无统计学意义。（2）rs3924587位点基因型分布频数：ISS组G/G、G/A 及 A/A 分布频数分别为 20、22、18例；对照组 G/G、G/A及 A/A分布频数分别为 22、18、20例。 两组在基因型构成比（χ2=1.336，P=0.513）和等位基因频率（χ2=1.053，P=0.305）上差异均无统计学意义。见表2及图1、2。

表2 Kiss-1基因rs5780218及rs3924587位点基因型分布频数

图 1 两组rs3924587位点基因型条形图

图 2 两组rs5780218位点基因型条形图

3 讨论

GHDD主要是由于下丘脑－垂体功能障碍等造成生长激素分泌不足，导致生长迟缓，1996年Lee等首次发现肿瘤转移抑制基因（Kiss－1基因），该基因在启动青春期生长发育、调控能量平衡及生物节律等方面具有重要作用。既往研究报道Kiss－1基因可参与生长激素（GH）的释放过程，用kisspeptin处理体外培养的大鼠和牛垂体细胞，可以促进GH分泌，提高血清中 GH 浓度［5］。 Kiss－1 基因表达、青春期启动、GH分泌成倍增加，青春期身高突增，生长发育加速，其作用机制是：下丘脑不同核区分泌的Kisspeptin与其受体结合，再通过下丘脑－垂体－性腺轴（hypothalamic－pituitary－gonadal axis，HPGA）的调控作用，引起性激素分泌增多，再通过负反馈调节机制使GH分泌增加，进而促进机体纵向生长［6］。

性早熟 （precocious puberty，PP） 主要是由于HPGA功能过早启动，促性腺激素释放激素（gonadotropin hormone，GnRH）脉冲分泌增强，出现第二性征发育、机体线性生长和骨龄迅速增加。生长发育是由GH和性激素（sex hormone，SH）协同作用的结果，PP也会导致身材矮小。既往研究发现矮小症患者经rhGH治疗可改善其性腺功能，可通过延缓诱导其青春发育年龄的方法，改善其终身高。国内外研究发现，Kiss－1基因单核苷酸多态性与性早熟的发生密切相关，Kiss－1基因被认为是性早熟的保护性基因［7］。在朝鲜、巴西、伊斯法罕地区PP患者及丧失青春发育进程的同家族成员中均发现存在 Kiss－1 基因的单核苷酸多态性改变［8－10］。 性早熟和单纯乳房早发育患者血清kisspeptin水平较正常女童显著增高［11，12］。身高的增长与骨骼生长板密切相关，性早熟患者大多身高增长加速，骨矿物质含量及骨密度明显增高，基于生长板功能在GHDD中的重要作用，由此推测GHDD与性早熟发病机制可能存在交叉点。

随着分子生物学及检测手段的不断发展，任何生长相关基因的单核苷酸多态性都可能与GHDD的发生有关，笔者推测，Kiss－1基因单核苷酸多态性与GHDD存在相关性，其可能机制是Kiss－1基因特异性位点的多态性造成表达蛋白的氨基酸序列不同，影响青春期的生长，从而导致终身高具有差异性。 该研究以 Kiss－1 基因 c.－145（rs5780218）和 C.－89（rs3924587）位点为切入点，发现对照组及GHDD组患者中均未检测到任何多态性改变，在GHDD组患者中两个SNP位点基因型构成比及等位基因频率与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）， 结 果提 示 rs5780218 和 rs3924587 位 点 与GHDD的发生可能不存在相关性，等位基因A、G、C、T既不是GHDD的保护性基因，也不是GHDD的易感基因，在降低GHDD的发病风险及预防等方面无明显作用，由此推测Kiss－1基因单核苷酸多态性可能与GHDD无相关性，但由于该研究对象均为河南地区GHDD患者，样本量少，种属不同，地区特征明显，该结论目前只在河南地区GHDD患者中成立，对于其他地区携带相关等位基因的患者需警惕GHDD的发生风险，需定期监测身高变化情况，从而可以在最佳治疗时间进行针对性治疗，避免延误病情。矮小症病因复杂多样，种属不同及地域差异等均可对研究结果产生影响，可通过扩大样本量等方法设计进一步的研究，或通过对Kiss－1基因相关位点基因编码的蛋白及其功能做进一步的研究，以便更深层次地探讨Kiss－1基因单核苷酸多态性与GHDD的相关性。

综上所述，Kiss－1基因rs5780218及rs3924587位点多态性与GHDD的发生无明显相关，但此次样本数量较少，有地区特性，该结论只在河南地区GHDD患者中成立。