一种新型罗丹明B类Fe3+荧光探针的合成及性能

陈玉婷，汪苏平，程文翰，曾小平，郑华明，吴江渝

武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北 武汉 430205

铁离子（Fe3+）是生物体中含量最多的过渡金属元素，在生物体的生命过程中起着至关重要的作用［1］，有极其重要的生理意义，在肌肉收缩、神经传导、酶催化、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的合成［2］、细胞内渗透压调节以及酸碱平衡维持等方面，均有铁元素的参与。一旦生物体内铁元素缺乏，就会发生各种各样生理系统紊乱，引起疾病［3-7］。而人体内的Fe3+含量一旦过高，心脏、肝脏、胰腺等器官将发生功能紊乱［8-9］。而且人们赖以生存的自然环境中铁元素也无处不在，固态主要以氧化铁的形式存在，液态中以Fe3+的形式存在。致使对Fe3+的检测需求逐步上升，因此开发性能优异的Fe3+检测工具是很有必要的，以便实时、在线动态检测生物体或环境中Fe3+的含量和分布。在生物体诸多的生理活动中，常用检测Fe3+的方法主要有原子吸收法［10-11］、电感耦合等离子体发射光谱法［12］、分光光度法［13］、电感耦合等离子体质谱法［14］、电化学法［15］及荧光分析法［16］等，但这些方法普遍存在流程复杂、检测设备贵重、检测成本高等缺点。而荧光探针由于其高选择性、高灵敏度和低成本在化学传感器研究领域越来越受到关注，并且利用罗丹明B（Rhodamine B，RhB）合成的探针分子在近些年受到极大重视［17-23］。

本文以RhB和水合肼为原料合成RhB酰肼（Rhodamine B hydrazide，RhB-NH2），再与苯甲醛一步反应制得一种新型罗丹明探针化合物RhB-P。RhB-P在V（乙腈）∶V（水）=1∶1的混合溶液中，对Fe3+有较高的选择性识别能力，并且灵敏度高、响应快。

1 实验部分

1.1 主要试剂

RhB（国药集团化学试剂有限公司，化学纯），水合肼（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），苯甲醛和盐酸（国药集团化学试剂有限公司，化学纯），氢氧化钠、冰醋酸、乙醇和乙腈（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），二次蒸馏水。

1.2 合成方法

以乙醇做溶剂，将RhB和水合肼反应后制得RhB-NH2，再与过量的苯甲醛反应，合成RhB-P。合成路线如图1所示。

图1 RhB-P探针的合成路线图Fig.1 Synthesis route of RhB-P probe

1.2.1 RhB酰肼的合成 采用文献［24］合成方法，准确称取1.0 g（2.07 mmol）的 RhB，将其溶解于40 mL乙醇中，磁力搅拌缓慢升温至回流。加入过量的水合肼（1 mL），5 h后直至粉红色消失。将冷却的反应混合物倒入蒸馏水中并用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发溶剂。产物在V（甲醇）∶V（丙酮）=1∶4的溶液中重结晶，为白色固体，产率为83.72%。

1.2.2 RhB-P探针的合成 将457 mg（1 mmol）RhB-NH2溶于10 mL无水乙醇中，缓慢升温至回流，加入0.5 mL苯甲醛，滴加3滴冰醋酸作催化剂，4 h后停止反应。待反应体系冷却至室温，将白色沉淀用无水乙醇洗涤3次，室温下真空干燥，得白色固体粉末，产率为63.79%。

1.3 结构表征

在傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectoscopy，FT-IR）仪（美国 Perkin Elmer公司，Spectrum Two型）上用KBr压片测定红外光谱，设定扫描范围为4 000 cm-1～500 cm-1，以此检测RhB-NH2和RhB-P的特征峰。

采用核磁共振波谱（nuclear magnetic reso⁃nance spectroscopy，NMR）仪（美国 Agilent公司，Agilent 400 MR型），以氘仿作溶剂，对RhB-NH2作结构分析；以DMSO-d6为溶剂，对探针RhB-P的结构做分析，前后对比进一步确定反应进程。

1.4 性能测试

1.4.1 探针分子RhB-P对Fe3+的选择性 采用紫外可见分光光度（UV-visible spectrophotometer，UV-Vis）计（美国Perkin Elmer公司，Agilent 400MR型），检测探针RhB-P分别与不同金属阳离子混合后的紫外吸收强度。以V（乙腈）∶V（水）=1∶1的混合溶液为溶剂，配制不同种类的金属阳离子（BaCl2，CaCl2，CuCl2，FeCl3，HgCl2，KCl，FeCl2，NaCl，MgCl2）溶液，用于金属阳离子与荧光探针分子RhB-P络合紫外-可见光吸收的强度测定，确定探针RhB-P的选择性识别能力。采用荧光光谱（fluorescence spectrophotometers）仪（美国 SLM公司，FL0910M014型），设置扫描范围为560 nm～680 nm，激发波长为560 nm，激发光狭缝和发射光狭缝分别为2.5 nm和5 nm。称取一定量的FeCl3和一种金属盐，共同溶于溶剂中得到浓度为40 μmol/L的混合溶液，称取一定量的探针RhB-P，配制成40 μmol/L的混合溶液。分别取3 mL上述两种溶液等体积混合，其最终浓度均为20 μmol/L。混合均匀，室温下静置30 min后测试荧光强度，检测荧光强度是否会受其它共存金属离子的干扰。

1.4.2 探针分子RhB-P对Fe3+的检测性能 配制1 mmol/L 的 FeCl3溶 液 ，稀 释 得 到 1 μmol/L～70 μmol/L的FeCl3溶液体系。分别取3 mL的FeCl3溶液与3 mL浓度为20 μmol/L的RhB-P探针溶液均匀混合后，室温下静置30 min。检测不同浓度Fe3+与探针RhB-P络合后荧光强度的变化趋势。

1.4.3 RhB-P探针分子与Fe3+的络合机理 通过等摩尔连续变化法测定探针RhB-P与Fe3+的络合比。固定RhB-P与Fe3+在溶液体系中的总浓度为40 μmol/L，改变探针 RhB-P与 Fe3+的组成比例，测定荧光强度的变化。

2 结果与讨论

2.1 荧光探针的表征

2.1.1 探针分子的FT-IR表征 RhB-NH2和探针RhB-P的FT-IR谱图如图2所示。2 970 cm-1和2 987 cm-1处为C-H伸缩振动峰，1 724 cm-1处出现的很强的峰为C=O伸缩振动吸收峰，新出现的1 587 cm-1处的吸收峰为C=N的伸缩振动吸收峰，818 cm-1和755 cm-1处为苯环上C-H弯曲振动吸收峰。说明胺和活性羰基缩合而成亚胺键，苯甲醛与RhB-NH2反应完全。

图2 RhB-NH2和RhB-P的FT-IR谱图Fig.2 FT-IR spectra of RhB-NH2and RhB-P

2.1.2 探针分子的1H-NMR表征 对RhB-NH2进行1H-NMR表征，核磁图谱如图3（a）所示。对于该化合物，所用核磁溶剂为氘仿，其测试数据如下：1H-NMR（CDCl3）δ：7.77（q，1H，Ar-H），7.48（m，2H，Ar-H），7.00（q，1H，Ar-H），6.37（d，2H，Xan⁃thenen-H），6.34（q，4H，Xanthenen-H），3.65（s，2H，NH2），3.30（q，8H，NCH2CH3），1.12（t，12H，NCH2CH3）。9种氢原子的个数比为 1∶2∶1∶2∶2∶2∶2∶8∶12，其对应的吸收峰的积分面积比为 1.00∶2.02∶1.03∶1.83∶1.90∶1.99∶2.02∶7.95∶11.97，这 与氢原子的个数比吻合，证明所得产物为RhB-NH2。

为进一步证实探针RhB-P的分子结构，对探针RhB-P的结构进行1H-NMR表征，核磁图谱如图3（b）所示。对于该化合物，所用核磁溶剂为DMSO-d6，其测试数据如下，1H-NMR（DMSO-d6）δ：8.90（s，1H，N=C-H），7.88（d，1H，Ar-H），7.58（m，2H，Ar-H），7.41（m，2H，Ar-H），7.33（m，3H，Ar-H），7.09（d，1H，Ar-H），6.43（d，2H，Xan⁃thene-H），6.39（d，2H，Xanthene-H），6.33（d，2H，Xanthene-H），3.31（q，8H，NCH2CH3），1.05（t，12H，NCH2CH3）。11种氢原子的个数比为 1∶1∶2∶2∶3∶1∶2∶2∶2∶8∶12，其对应的吸收峰的积分面积比 为 1.00∶0.98∶1.98∶2.03∶3.04∶1.04∶2.00∶1.99∶2.01∶8.04∶11.98，这与氢原子的个数比相符，证明所得产物为目标化合物。

图3 1H-NMR谱：（a）RhB-NH2，（b）探针分子RhB-PFig.3 1H-NMR spectra：（a）RhB-NH2，（b）fluorescent probe RhB-P

2.2 RhB-P探针分子对Fe3+的检测

2.2.1 UV-Vis检测 为了确定探针RhB-P对不同金属阳离子的选择性识别能力，选择Na+，K+，Mg2+，Ba2+，Ca2+，Cu2+，Hg2+，Fe2+，Fe3+为识别对象，其盐溶液与RhB-P的溶液混合后检测其吸光度，结果如图4所示。实验发现，Fe3+的组别在560 nm有明显的吸收峰，溶液的颜色也由无色变为肉眼可识别的枚红色，这是由于Fe3+诱导电子发生转移导致螺环结构打开；而其它组别中，溶液基本保持无色状态，此时RhB-P探针主要以螺环形式存在。所有测试条件下金属离子的浓度均为20 μmol/L。

图4 探针RhB-P对不同金属离子UV-Vis谱Fig.4 UV-Vis absorption spectra of RhB-P for several metal ions

2.2.2 荧光检测 为进一步确认RhB-P探针对Fe3+的响应特性，将 Na+，K+，Mg2+，Ba2+，Ca2+，Cu2+，Hg2+，Fe2+，Fe3+的金属盐溶液分别与 RhB-P 的溶液混合后进行荧光测试，结果如图5（a）所示。实验发现，未加Fe3+的组别，经检测在586 nm的波长处未显示明显荧光增强，而加入Fe3+的组别，在586 nm处有明显的荧光强度出现。所有离子的浓度均为20 μmol/L。为考察探针分子的抗干扰性能，在其他离子共存的情况下，测定混合体系的灾光强度，实验结果如图5（b）所示。探针RhB-P作为检测Fe3+的荧光化学传感器具有良好的抗干扰能力，在检测过程中其他金属离子不会对检测结果带来明显的干扰。不同浓度的Fe3+对探针RhB-P的荧光光谱的影响如图5（c）所示，结果表明，随着Fe3+浓度的升高，溶液的荧光强度逐渐增大。在586 nm处，Fe3+浓度与荧光强度的关系如图 5（d）所示，Fe3+浓度在 0.1 μmol/L～20 μmol/L 范围内与RhB-P探针的荧光强度呈良好的线性关系，表明RhB-P探针分子可以定量检测此范围内Fe3+的浓度。根据检出限公式：LOD=3 δ/S（LOD为检出限，δ为空白样数据标准偏差，S为标准曲线斜率），计算得该探针的检出限为0.058 μmol/L。

图5 （a）不同金属离子条件下探针RhB-P的荧光光谱图，（b）不同金属离子与Fe3+共存条件下探针RhB-P的荧光强度变化图，（c）不同Fe3+浓度条件下探针RhB-P的荧光光谱图，（d）Fe3+浓度与探针RhB-P的荧光强度的线性关系图Fig.5 （a）Fluorescence spectra of probe RhB-P with different metal ions，（b）fluorescence response of RhB-P prode to various metal ions with Fe3+，（c）fluorescence spectra of RhB-P upon various concentration of Fe3+，and（d）linear relationship between fluorescence intensity of RhB-P probe and Fe3+concentration

2.3 RhB-P探针与Fe3+的络合方式

为了进一步确定Fe3+与RhB-P探针之间的络合比，采用等物质的量连续变化法，使探针RhB-P与 Fe3+的总浓度保持 40 μmol/L，随着 Fe3+摩尔分数的不断改变，体系的荧光强度随之变化，如图6（a）所示。当Fe3+的摩尔分数为0.5时，探针RhB-P与Fe3+在586 nm处呈现荧光强度最大值，表明探针化合物与Fe3+的络合比是1∶1，推测其络合方式可能如图6（b）所示。

图6 （a）探针RhB-P与Fe3+的Job's Plot曲线，（b）探针RhB-P和Fe3+的配位反应机理Fig.6 （a）Job's plot of fluorescent RhB-P probe and Fe3+，（b）coordination reaction mechanism of RhB-P probe with Fe3+

3 结 语

本文以RhB、水合肼和苯甲醛为原料，经两步反应得到一种新型荧光探针分子RhB-P，其对Fe3+能进行选择性识别，且灵敏度高。可裸眼观察其颜色变化，并在UV-Vis光谱中于560 nm处有明显的吸收峰；在荧光光谱中586 nm处，随着Fe3+浓度增大有明显的荧光增强。Fe3+浓度在0.1 μmol/L～20 μmol/L范围内与探针RhB-P的荧光强度呈良好的线性关系，其在V（乙腈）∶V（水）=1∶1的溶液中检出限为0.058 μmol/L。该探针分子有望用于河水、土壤样品中Fe3+浓度的测定，并有望在水质检测、食品安全等方面取得应用。