小儿退热合剂定性定量研究

2018-10-24邹恺平周琴妹

江苏中医药 2018年10期

王迅邹恺平周琴妹张源

（南京中医药大学附属医院，江苏南京210029）

小儿退热合剂为江苏省中医院儿科用药，由荆芥、防风、黄柏、钩藤、大黄等中药组成，功效辛凉解表、祛风退热，用于上呼吸道感染、流行性感冒之发热症[1-2]，作为江苏省中医院特色医疗机构制剂，临床疗效十分显著。为进一步提高制剂的质量标准和稳定性，本实验在小儿退热合剂原质量标准的基础上，对方中黄柏和钩藤进行了薄层定性鉴别研究，并对大黄中5种蒽醌类成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进行了含量测定研究，现将结果报道如下。

1 材料

1.1 药材与试剂黄柏对照药材（批号：121510-201105），盐酸黄柏碱对照品（批号：111895-201202），异构藤碱对照品（批号：111927-201102），芦荟大黄素对照品（批号：110795-201007），大黄酸对照品（批号：110757-200206），大黄素对照品（批号：110756-200110），大黄酚对照品（批号：110796-201118），大黄素甲醚对照品（批号：110758-201013），均购自中国食品药品检定研究院。荆芥（批号：140202），防风（批号：131016），黄柏（批号：131122），石膏（批号：131210），钩藤（批号：140225），薄荷（批号：140312），大黄（批号：131116），以上饮片均购自南京松龄中药饮片有限公司。小儿退热合剂（批号：1601001、1601002、1601003），由江苏省中医院制剂部生产。

1.2 主要仪器高效液相色谱仪（1260S型，美国Agilent公司）；凝胶成像分析仪（型号WD-9413A，北京市六一仪器厂）；电热恒温鼓风干燥箱（型号DHG-9123A，上海精宏实验设备仪器厂）；医用超声波清洗仪（型号KQ-1000E，昆山市超声仪器有限公司）；万分之一电子天平（AX224ZH/E，美国OHAUS Corp）；十万分之一电子天平（AR2140型，美国OHAUS Corp）；HH-2型数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 黄柏的薄层鉴别供试品溶液制备：取小儿退热合剂10mL，蒸干，加1%醋酸甲醇溶液50mL，于60℃超声处理20min，滤过，滤液浓缩至2mL作为供试品溶液。阴性供试品溶液制备：制备不含黄柏的小儿退热合剂，同供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液作为对照品溶液。对照药材溶液制备：取黄柏对照药材0.1g，加1%醋酸甲醇20mL于60℃超声处理20min，滤过，滤液浓缩至2mL作为对照药材溶液。按照薄层色谱法试验，吸取上述4种试液各3～5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4）的下层溶液为展开剂，置于氨蒸汽饱和展开缸展开，取出，晾干，喷稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见图1。

2.1.2 黄柏鉴别方法的耐用性考察取上述供试品溶液、对照品溶液各5µL，分别同时点于两硅胶板上，按建立的薄层鉴别条件，分别在温度10℃、湿度32%和温度35℃、湿度72%条件下展开，取出，晾干，显色。结果显示，分离度较好，重现性好，见图1。

2.1.3 钩藤的薄层鉴别供试品溶液制备：取小儿退热合剂30mL，加浓氨试液15mL和三氯甲烷50mL，加热回流2h，放冷静置，取三氯甲烷层，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，即得。阴性供试品溶液制备：制备不含钩藤的小儿退热合剂，同供试品溶液制备方法制得阴性供试品溶液。对照品溶液制备：取异钩藤碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，吸取供试品及阴性供试品溶液各10～30µL，对照品溶液5µL分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（6∶4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，结果见图2。

2.1.4 钩藤鉴别方法的耐用性考察取上述供试品溶液15µL、对照品溶液5µL，分别同时点于两硅胶板上，按建立的薄层鉴别条件，分别在温度10℃、湿度32%和温度35℃、湿度72%条件下展开，取出，晾干，显色。结果显示，分离度较好，重现性好，见图2。

2.2 含量测定

2.2.1 对照品溶液制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素352.9µg、大黄酸728.8µg、大黄素324.2µg、大黄酚484.7µg，大黄素甲醚109.3µg的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液与阴性供试品溶液制备取本品1mL置具塞锥形瓶中，加8%盐酸溶液10mL，超声（功率280W，频率50kHz）10min，加入三氯甲烷10mL，加热回流1h，放冷，转移至分液漏斗，再加三氯甲烷10mL，振摇提取3次，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。同法制备阴性样品。

2.2.3 色谱条件及专属性考察色谱柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5µm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（83∶17）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10µL；检测波长：254nm。结果见图3，被测成分色谱峰分离度良好，阴性无干扰。

2.2.4 线性关系考察精密量取“2.2.1”项下对照品溶液适量，制成含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的浓度分别为35.29、72.88、32.42、48.47、10.93µg/mL的混合对照品溶液，依次稀释2、4、8、16、32倍。精密吸取上述溶液10µL，按照“2.2.3”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积。以峰面积值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，得5种对照品的线性回归方程，结果见表1。

2.2.5 精密度考察精密吸取“2.2.4”项下混合对照品溶液，连续进样6次，计算5种成分对照品的RSD分别为0.13%、0.20%、0.48%、0.24%、0.79%，RSD均小于5%，结果表明仪器精密度良好。

图1 小儿退热合剂黄柏鉴别及温湿度耐用性薄层图谱

图2 小儿退热合剂钩藤的鉴别及温湿度耐用性薄层图谱

图3 HPLC色谱图

2.2.6 稳定性考察取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积值。结果显示5种成分的RSD分别为1.16%、1.00%、1.86%、1.42%、1.96%，均小于5%，结果表明供试品溶液在24h内稳定良好。

2.2.7 重复性考察精密吸取同一批号（1601001）样品1mL，共6份，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法进行制备，进样，测定峰面积值。结果显示5种成分的RSD分别为0.91%、0.73%、0.77%、0.38%、1.09%，表明重复性良好。

2.2.8 加样回收试验精密吸取已知含量的样品（批号1601001）1mL，共6份，精密加入一定量的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法进行制备，进样，测定峰面积值，计算，结果见表2。

2.2.9 3批样品含量测定取3批样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法进行制备，测定，计算，结果见表3。

3 讨论

3.1 定性鉴别小儿退热合剂的原标准中仅有理化鉴别项，本研究参考药典及文献的方法，对小儿退热合剂中的黄柏和钩藤进行了薄层定性鉴别研究[3-4]。实验所得到的薄层色谱图斑点清晰，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。在此基

础上，本研究还对两种方法进行了不同温湿度的耐用性考察，结果显示方法的重现性好。因此，可以考虑将上述薄层定性鉴别方法列入质量标准。

本实验在薄层鉴别的过程中考察了不同点样量及不同对照品（化学对照品和对照药材）在薄层色谱图上的效果，最终选择了相对合适的点样量和对照品进行实验。

3.2 含量测定本研究的含量测定选用小儿退热合剂中大黄的5种蒽醌类成分作为指标成分，实验中考察了不同有机相（甲醇和乙腈）以及不同比例的流动相的分离效果[5-7]，最终选择了甲醇-0.1%磷酸溶液（83∶17）的流动相比例，该条件下各峰分离度良好，且在较短时间内（30min）全部出峰，可以较好地进行测定。