针刺对变应性鼻炎模型大鼠血清IL-4、IL-12、GATA-3 mRNA水平的影响

2018-10-24郭清华

江苏中医药 2018年10期

郭清华王旭刘玉

（南京市中西医结合医院，江苏南京210014）

变应性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）是机体暴露于变应原后由IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，典型症状为阵发性喷嚏、清水样涕、鼻痒和鼻塞[1]。目前，变应性鼻炎流行率有全球逐年增加的趋势。2015年，美国变应性鼻炎临床指南首次将针刺疗法作为可选择的方案之一进行推荐[2]。针刺治疗变应性鼻炎不但能取得较好的疗效，而且有副作用小、复发率低、成本较低等优点。孙氏等[3]通过分析近10年的临床报道发现针刺治疗过敏性鼻炎疗效可靠，操作简单，同时也提出应加强针刺治疗过敏性鼻炎的实验和作用机理研究，尤其是从免疫学角度。本研究制作变应性鼻炎大鼠模型，观察针刺疗法对AR模型大鼠的疗效及其对大鼠血清白介素-4（IL-4）、IL-12、GATA-3 mRNA水平的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物健康wistar大鼠，雌雄各半，清洁级，体重（200±20）g，由扬州大学比较医学中心提供，动物合格证号：SCXK2012-004，适应性喂养1周。

1.2 主要试剂与药物 IL-12试剂盒、IL-4试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；氢氧化铝干粉，上海凌峰化学试剂有限公司；卵白蛋白，sigma公司；氯雷他定糖浆，MSD Belgium BVBA/SPRL（比利时）；一次性针灸针，环球牌，0.18mm×13mm；氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、无水乙醇，分析纯，南京化学试剂股份有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司；Trizol、M-MLV反转录酶等逆转录试剂、DNA marker、Taq DNA聚合酶反应体系，TaKaRa公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司合成。内参引物序列见表1。

1.3 主要仪器全自动荧光PCR分析仪，美国Branchburg公司；台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；核酸蛋白检测仪，Thermo公司。

表1 内参引物序列

2 实验方法

2.1 造模与分组将wistar大鼠适应性喂养1周后，按照安云芳等[4]报道的方法造模。（1）基础致敏：每只大鼠予用卵清蛋白（OVA）0.3mg+氢氧化铝30mg+生理盐水1mL制成的混悬液，腹腔注射，隔日1次，共7次。（2）激发阶段：腹腔注射OVA结束后第2天即开始激发，每只大鼠予5%OVA 50µL滴鼻，每日1次，连续7d。另取10只大鼠为空白组，用生理盐水代替OVA，其余方法不变。采用叠加量化记分法评价造模是否成功，总分＞5分表示造模成功。记分方法：（1）鼻痒。轻搔鼻1～2次为1分，剧烈搔抓鼻四周2分。（2）喷嚏。1～3个为1分，4～10个2分，11个以上3分。（3）清涕。流至鼻孔为1分，超出前鼻孔2分，涕流满面3分。将造模成功的大鼠随机分为模型组、针刺组、西药组。

2.2 干预方法从实验第21天开始，用针刺和氯雷他定糖浆对实验鼠进行干预。

2.2.1 针刺组选择大椎、肺俞（双）、肾俞（双）。穴位定位参考《常用实验动物穴位定位》。大椎位于第7颈椎与第1胸椎间，背部正中；肺俞位于第3胸椎下两旁肋间；肾俞位于第2腰椎下两旁肋间。安抚大鼠后，左手按压大鼠，食指和中指置于穴位两侧，绷紧穴位处皮肤，右手持针，快速垂直进针，针身进入后约10min捻转1次，采用提插捻转平补平泻针法，行针1min，共留针30min，每日1次，连用14d。

2.2.2 西药组根据人与动物等效剂量换算方法，按人与各种动物以及各种动物之间用药剂量换算公式：B种动物的剂量（mg/kg）＝W×A种动物的剂量（mg/kg），W为折算系数（大鼠折算系数为0.018），计算大鼠氯雷他定糖浆用药量，予每次0.9mg/kg灌胃方式给药，每日灌胃1次，连用14d。

2.2.3 模型组和空白组模型组予生理盐水灌胃，2mL/d，每日1次，连用14d。空白组不予任何干预。

2.3 标本采集（1）血清采集：各组大鼠末次处理后，以10%水合氯酸，3mL/kg进行麻醉，采用摘眼球采血方式，将所采血液缓慢置入采血管，摇匀，离心，取血清。分取血清至冻存管中，-80℃冰箱保存备用，测定前置室温复融。（2）鼻黏膜采集：大鼠采血完毕后，行断头处死，迅速剥除上颌骨部皮肤，将上颌骨从项骨中分离出来，分离鼻中隔与鼻黏膜，取双侧鼻黏膜。部分鼻黏膜在10%甲醛溶液中固定，用于鼻黏膜观察；其余黏膜用液氮速冻后放置于-80℃冰箱保存，用于qPCR检测。

2.4 指标检测

2.4.1 症状比较根据症状评分法用叠加量化记分法记分比较各组大鼠用药前后症状积分。

2.4.2 鼻黏膜观察将10%甲醛溶液中固定的大鼠鼻黏膜，经组织脱水、石腊包埋、切片、脱腊、苏木精-伊红染色、脱水、透明、封固等操作后，在显微镜下观测实验大鼠鼻黏膜组织学改变及嗜酸性粒细胞计数。

2.4.3 血清IL-4、IL-12水平检测根据酶标仪检测得到大鼠血清的吸光值，利用标准曲线的方程式计算得出待检样品中IL-4、IL-12的浓度（pg/mL）。根据试剂盒说明书，各试剂在使用前平衡至室温。对比各组大鼠血清IL-4、IL-12水平。

2.4.4 大鼠鼻黏膜GATA-3 mRNA检测将-80℃冰箱中保存的大鼠鼻黏膜采用TRIzol试剂提取总RNA，确定总RNA浓度及纯度后进行逆转录合成cDNA，进行实时荧光定量分析。以每个标准拷贝数的对数为横坐标，以荧光信号达到设定闭值时所经过的循环数值（Ct值）为纵坐标，绘制标准曲线，得出GATA-3 mRNA的扩增曲线良好，融解曲线峰形单一。以精密度和回收率考证方法根据被检测样品的Ct值，通过标准曲线计算出样本的模板拷贝数。同时，引入内参基因GAPDH以减少样品间差异，并记录两者Ct值。

2.5 统计学方法在SPSS 21.0建库并进行统计学分析，数据以（±s）表示，符合正态分布且方差齐的组间资料采用方差分析，非正态分布或方差不齐的采用多个样本非参数检验，当P＜0.05时为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠干预后变应性鼻炎症状评分比较干预后各组大鼠变应性鼻炎症状评分分别为：空白组（2.4±1.35）分，模型组（6.7±1.57）分，针刺组（3.0±0.82）分，西药组（2.9±0.99）分。模型组大鼠评分明显高于空白组（P＜0.01）；针刺组和西药组评分明显低于模型组（P＜0.05）；针刺组与西药组比较，差异无统计学意义（P＝0.855）。

3.2 各组大鼠鼻黏膜组织学比较空白组大鼠鼻黏膜组织几乎无嗜酸性粒细胞浸润；模型组鼻黏膜组织水肿，血管扩张，大量嗜酸性粒细胞浸润，表明嗜酸性粒细胞在变应性鼻炎致敏中起重要作用；针刺组和西药组鼻黏膜少量嗜酸性粒细胞聚集，无明显充血水肿、血管扩张的改变。见图1。

3.3 各组大鼠血清IL-4、IL-12及鼻黏膜GATA-3 mRNA水平比较结果见表2。针刺组与西药组各指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。大鼠鼻黏膜GATA-3 mRNA的表达，通过计算△Ct＝Ct（目的基因）－Ct（内参基因），以△Ct进行组间差异性比较。△△Ct＝△Ct（治疗组）－△Ct（模型组），计算出GATA-3 mRNA的相对表达量2-△△ct，2-△△ct的大小表示各组原始数值的关系，值越大表达量越高，值越小表达量越小。

4 讨论

变应性鼻炎属中医学“鼻鼽”范畴，其发病机制主要是由于肺、肾虚损，水湿犯鼻而致病。现代医学认为，变应性鼻炎是环境因素作用于机体导致异常免疫反应，大量研究表明Th1和Th2细胞间免疫反应失衡是导致变应性鼻炎发生的免疫学基础之一[5]，辅助性T淋巴细胞亚群可以分为Th1和Th2两种类型，它们通过所分泌的细胞因子相互调节，以维持机体免疫功能的平衡。正常情况下，Th按一定比例向Th1、Th2分化，两者处于相对平衡状态，维持着机体正常的细胞免疫和体液免疫功能。当机体受到异常抗原刺激时，上述平衡被打破，Th1、Th2细胞中Th2亚群表达升高，而Th1亚群表达降低。其中，Th2细胞起重要的作用，因为它能够释放关键的细胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13，特别是IL-4能够促进IgE的产生，IL-5能引起嗜酸性粒细胞的汇聚和活化，由此产生了“变态反应中的Th2假说”。这个假说已得到实验研究和基础研究的支持[6]。现已知道，变应性鼻炎Th1类细胞显著降低，而Th2类细胞显著升高，即发生明显的Th细胞向Th2偏移，多条信号通路参与了Th2偏移的发生，而GATA-3是Th2偏移的核心信号分子[7]。

本研究结果表明，变应性鼻炎模型大鼠血清存在IL-4水平升高、GATA-3 mRNA的高表达及IL-12水平的降低。针刺能改善大鼠鼻部过敏的症状，以及鼻黏膜过敏状态；能显著升高变应性鼻炎大鼠血清IL-12含量，同时降低其血清IL-4含量，降低大鼠鼻黏膜GATA-3 mRNA的表达。GATA-3是Th类细胞因子的上游基因，因此，降低大鼠鼻黏膜GATA-3 mRNA的表达，调节变应性鼻炎大鼠血清中IL-4和IL-12水平，可能是针刺治疗变应性鼻炎的机制之一。