SLE患者血清CXCL13水平与肾脏受累的相关性研究＊

何德宁，胡建康，朱静茹，戴森华，柳毓文，胡娜

(江西省萍乡市人民医院风湿免疫科，萍乡 337000)

系统性红斑狼疮（SLE）是一种多系统受累、多种自身抗体分泌的自身免疫性疾病。SLE病因未完全明确，通过对动物模型及狼疮患者研究发现，B细胞异常在SLE发生发展过程中发挥着重要作用。B细胞是免疫系统重要组成部分，不仅是抗体分泌前体细胞，而且具有抗原递呈、免疫调节等功能。B细胞生物靶向治疗在难治性狼疮取得一定疗效，使得人们越来越重视B细胞在SLE中的作用[1，2]。CXCL13是属于趋化因子家族中一个小的细胞因子，通过与其受体CXCR5结合调节不同类型白细胞的运输。由于它具有吸引B细胞的能力，又被称为B淋巴细胞趋化因子（BLC）。CXCL13可以选择性作用于不同亚群B淋巴细胞，是最有力的B细胞趋化因子之一。已有研究发现[3]，类风湿关节炎患者关节滑膜异位淋巴滤泡组织中CXCL13异常表达，病情控制后CXCL13下降，并且CXCL13与DAS28评分呈正相关。在NZB/W-F1狼疮模型小鼠中[4]，CXCL13是狼疮肾炎发生过程中极其重要的一种细胞因子。为此，我们通过对LN患者血清CXCL13研究，并观察不同分类LN患者CXCL13变化，进一步探讨SLE发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 所有入选SLE患者均符合1997年美国风湿病学会 （ACR）修订的SLE分类标准11项中的4项或以上，年龄小于70岁，无乙肝相关性肾炎，无并发感染或/和肿瘤，无严重心肺功能不全。LN诊断应满足下列条件之一：⑴ANA阳性并肾活检病理有LN典型特征；⑵确诊SLE患者，并满足下列条件之一：24h尿蛋白大于0.5g；或3+；或尿红细胞数大于5个/高倍镜视野、尿白细胞数大于5个/高倍镜视野并且排除由于尿路感染引起；或管型（红细胞、血红蛋白、颗粒或混合管型）。所有入选LN病例均进行肾穿刺行常规病理检查并免疫组化法检测CD3、CD20、CD21表达。入组情况：LN患者89例，无肾脏受累SLE患者25例，健康对照者11例。各组间年龄、性别比无差异。记录受试者详细临床资料。

1.2 主要试剂和仪器 CXCL13试剂盒购于美国R&D 公司。 CD3 抗体：clone PS1，Novacastra；CD20抗 体 ：clone L26，DAKO 公 司 ；CD21 抗 体 ：clone 2G9，基因公司。免疫组化检测试剂盒：DAKO EnVision plus。经皮自动活检枪：德国BARD公司MN1616。

1.3 实验方法

1.3.1 血清CXCL13浓度测定 抽取受试者早晨空腹血2ml，3000r/min离心5min，血清分装后于-80℃冰箱保存备用。CXCL13检测采用ELISA法，具体操作同试剂盒说明书。

1.3.2 肾组织CD3、CD20、CD21表达 肾脏穿刺活检方法采用B超引导下，定位右肾下极，经皮自动活检枪穿刺，获得1.5-2厘米长度肾组织3条。所有入选的肾组织标本用10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，切片厚3-4μm，常规行苏木素伊红（HE）染色、过碘酸-schiff（PAS）、六胺银（PASMMasson）染色、马松三色（Masson-Trichrome）染色。以 CD20 （1：800） 作为 B 细胞表面标记、CD3（1：100）作为T细胞表面标记、CD21作为滤泡树突状细胞（FDC）的表面标记，在病理石蜡连续切片上进行染色。用扁桃体组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 统计学处理 SPSS 17.0统计软件分析。数据以中位数（四分位数）表示，两组间比较采用Mann-Whiney或Wilcoxon检验，多组间比较采用方差分析，两两相关性分析采用Spearman法，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE患者血清CXCL13异常表达 根据有无肾脏受累，将 SLE 患者（n=114）分为 LN 组（n=89）及无肾脏受累SLE组（n=25）。SLE患者血清CXCL13水平[230.65(145.92-365.40)pg/ml]明显高于健康对照者[85.13(62.23-131.58)pg/ml](Z=4.42，P＜0.001)。并且，LN患者CXCL13水平 [258.86(185.50-392.18)pg/ml]高于无肾脏受累SLE患者 [136.39(104.23-257.50)pg/ml](Z=2.53，P=0.01)。

2.2 CXCL13与SLE病情相关性 SLE患者血清CXCL13水平与 SLEDAI呈正相关 (r=0.55，P＜0.001)，与补体 C3 呈负相关(r=-0.39，P＜0.001)，而与抗ds-DNA抗体滴度无明显相关 （r=0.037，P=0.72）。

2.3 不同分类LN患者CXCL13表达

2.3.1 WTO病理分类LN患者CXCL13表达变化入选89例LN患者中，Ⅲ型21例，Ⅳ型53例，V型15例，无Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ病例。Ⅲ型和Ⅳ型LN患者血清CXCL13水平均较V型LN患者升高（Ⅲ型287.58(198.25-355.44)pg/ml，Ⅳ型 271.96(189.71-434.99)pg/ml，V 型 169.71(101.09-252.69)pg/ml；Ⅲ型 vs V 型，P=0.013；Ⅳ型 vs V 型，P=0.002），而Ⅲ型和Ⅳ型LN患者血清CXCL13水平表达无差异 （P=0.39）。

2.3.2 免疫组化分类LN患者CXCL13表达变化

2.3.2.1 根据肾组织有无CD20细胞表达将病例分为B细胞组（69例）和无B细胞组（20例）。B细胞组血清CXCL13水平[287.57(196.37-416.71)pg/ml]高于无B细胞组[200.13(139.07-239.81)pg/ml](Z=2.844，P=0.004)。

2.3.2.2 根据CD20+细胞、CD3+细胞和CD21+细胞共表达模式差异，将病例分为四类[5]：0类：CD20+细胞无表达，或仅有CD3+细胞表达，无CD21+细胞表达；1类：CD20+细胞表达，和/或CD3+细胞表达，若同时有CD3+及CD20+细胞表达两者呈散在分布，无 CD21+细胞表达；2类：CD20+细胞及CD3+细胞均有表达且两者呈区域分布，无CD21+细胞表达，形成非典型ELT；3类：CD20+细胞及CD3+细胞均有表达呈区域分布，同时有CD21+细胞表达，形成典型ELT。本研究中，0类病例20例，1类18例，2类51例，未发现3类LN病例。2类患者血清CXCL13水平较0类和1类患者均显著升高（0 类 180.96(101.93-218.88)pg/ml，1 类 216.91(158.47-327.15)pg/ml，2 类 351.80(251.13-470.36)pg/ml；2 类 vs 0 类：Z=4.79，P＜0.001；2 类 vs 1 类：Z=2.32，P=0.02）。同时，1 类患者血清 CXCL13 水平较 0 类患者升高（Z=2.13，P=0.033）。

表1 不同病理类型LN肾组织ELT形成模式

2.4 LN患者治疗前后CXCL13变化 我们随访10例初诊LN患者，予激素、免疫抑制剂治疗。治疗6月后血清CXCL13及SLEDAI均较治疗前明显下降[CXCL13：321.45(197.52-428.02)pg/ml vs 195.54(165.98-233.01)pg/ml，Z=-2.59，P=0.009；SLEDAI：10(8.75-12)vs 6(4-6.5)，Z=-2.56，P=0.01]。

3 讨论

趋化因子是一组小分子质量蛋白质的集合，分子量多为8-11KDa，其在B、T淋巴细胞迁移和聚集并参与炎症反应过程中发挥了重要作用。CXCL13主要由次级淋巴组织、淋巴结和滤泡中的树突状细胞分泌，其异常表达可以促进炎症细胞聚集，引起非淋巴器官形成含有生发中心的异位淋巴样组织（ETL）。其受体CXCR5主要分布于次级淋巴器官中的成熟B细胞和部分T辅助记忆细胞。CXCL13与CXCR5共同作用引导成熟B细胞游走及归巢过程。CXCL13在SLE发病机制中的作用受到广泛关注。国内研究报道[6]，SLE患者血浆CXCL13表达水平明显高于健康对照者，有靶器官（肾脏、中枢神经系统）受累的SLE患者血浆CXCL13水平较无器官受累的SLE患者明显升高，并且CXCL13与SLE疾病活动指数呈正相关。国外研究也有类似报道[7，8]，并且发现SLE患者血清CXCL13水平与补体C3呈负相关，与抗ds-DNA抗体滴度呈正相关。与大部分研究结果相似，我们发现LN患者血清CXCL13水平明显高于无肾脏受累SLE患者和健康对照者。血清CXCL13水平与狼疮活动度SLEDAI呈正相关，与补体C3呈负相关，但与抗ds-DNA抗体滴度无相关。研究结果提示我们，CXCL13可能参与SLE靶器官受累。

肾脏是SLE最常累及的靶向器官，对LN患者CXCL13的研究可进一步了解红斑狼疮器官损害过程。通过对狼疮模型小鼠研究发现[9]，CXCL13过度表达可以诱导非淋巴器官异位淋巴组织形成并通过炎症细胞在肾组织聚集导致疾病恶化。MRL/lpr小鼠接受CXCL13抗体治疗6周后尿蛋白、血肌酐下降，肾脏病理损伤减轻[10]。有研究报道[11]，LN患者肾穿刺组织中，B细胞浸润组织CXCL13蛋白及mRNA表达明显增加。研究还发现，受累器官中有B细胞浸润的患者愈后相对更差。为进一步了解CXCL13与肾组织B细胞浸润关系，我们检测LN患者血清CXCL13并同时观察穿刺肾组织B细胞浸润情况。研究发现，LN患者肾组织B细胞浸润率高达76.4%，有B细胞浸润LN患者血清CXCL13水平较无B细胞浸润患者明显升高。不同病理类型LN患者CXCL13水平也存在差异，Ⅲ、Ⅳ型LN患者血清CXCL13表达异常升高。由于研究条件限制，本研究未能纳进Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ型LN患者。研究还发现，血清CXCL13与LN患者肾脏B细胞浸润模式相关。血清CXCL13水平越高，肾组织B、T淋巴细胞浸润越明显并越可能形成ETL；而CXCL13越低，肾组织中B细胞浸润减少。经激素、免疫抑制剂有效治疗后随着疾病的控制CXCL13水平亦下降。上述研究结果提示我们，CXCL13在SLE病程中肾脏受累发挥了重要作用，它可能参与B细胞游走及归巢过程，诱导B细胞在靶器官中异常聚集并形成ETL。同时，CXCL13水平升高明显的SLE/LN患者，更需要积极的、长期的治疗。

CXCL13在室温中可稳定表达至少24h，经过多次冻融后水平仍稳定，为其广泛用于临床检测提供了良好条件[12]。综上所述，CXCL13可能成为评判SLE疾病活动的有效指标，对SLE病情严重程度、肾脏累及情况及愈后的判断有一定的应用价值，也为SLE治疗学研究提供新的思路和靶点。