多烯磷脂酰胆碱在裸鼠模型中逆转胃癌细胞奥沙利铂耐药的作用及机制研究

伊庆亭 张红军 姜 韬 傅佳雷 华明涛

胃癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一，进展快、预后差，其发病率及死亡率居恶性肿瘤第3位[1]，仅次于肺癌和肝癌。目前主要以奥沙利铂为主的第三代铂类药物的化疗为治疗胃癌的首选化疗方案[2]，但是铂类药物的耐药是目前胃癌化疗亟待解决的问题之一。因此寻找有效措施逆转胃癌对化疗药物的耐药性对改善胃癌治疗效果有重要的意义。

多烯磷脂酰胆碱(Polyenephosphatidylchol，PPC)是一种生理性磷脂，可以作为一种临床常用的保肝药物，课题组在前期研究其对化疗药物抗肿瘤活性的影响中发现，多烯磷脂酰胆碱在胃癌SGC-7901细胞实验中可与奥沙利铂产生协同抗肿瘤作用[3]。本研究通过观察多烯磷脂酰胆碱联合奥沙利铂对裸鼠荷瘤胃癌细胞SGC-7901/L-OHP增殖的影响，探讨多烯磷脂酰胆碱可能通过TLR4/Nanog/ABCF2途径逆转胃癌耐药细胞对铂类药物的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 药物、动物与试剂

细胞株：人胃腺癌耐奥沙利铂细胞株SGC-7901/L-OHP由上海生命科学研究院(中国科学院)细胞资源中心惠赠。饲养动物：BALB/c雌性裸鼠40只，4～5周龄左右，体重在18～21 g左右，购自上海斯莱克实验动物技术有限公司，于青岛大学中心实验室动物饲养中心在无特定病原体(PSF)环境下饲养。药品：多烯磷脂酰胆碱(PPC)购自成都天台山制药有限公司；奥沙利铂购自江苏恒瑞医药股份有限公司。主要试剂：RPMI 1640培养液购自美国Gibcol BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青生物公司；胰蛋白酶购自美国Amresco公司；TLR4/Nanog/ABCF2抗体购自中国Elabscience公司；总RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司；RT-RNA试剂盒RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自TaKaRa公司。

1.2 细胞的培养和人胃癌裸鼠模型的建立

人胃腺癌耐药细胞株SGC7901/L-OHP常规传代，并培养于(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)RPMI 1640培养液中，并于37℃，5%CO2培养箱中培养生长。每3天传代1次。待细胞稳定传代后，用胰酶将处于对数生长期的细胞消化，制备成细胞密度为5×106/L的单细胞悬液。将细胞悬液0.2 mL注射于裸鼠右颈部皮下，大约10天以后，被接种细胞悬液的裸鼠右颈部皮下均出现长径约5～8 mm的皮下结节，提示移植瘤模型建立成功。

1.3 分组与处理

将40只人胃癌裸鼠移植瘤模型随机分为空白对照组、多烯磷脂酰胆碱(PPC)组、奥沙利铂(L-OHP)组及奥沙利铂联合多烯磷脂酰胆碱(L-OHP+PPC)组共4组，每组10只：当移植瘤直径达5～8 mm左右时给予药物治疗，空白对照组给予葡萄糖注射液0.2 mL/(只·d)，L-OHP组中L-OHP剂量按30 mg/kg体重计，每3天腹腔注射给药一次，每次6 mg/kg，连续给药5次；PPC组中PPC按140 mg/kg体重计，为每天腹腔注射用药，每次10 mg/kg，连续给药14次。L-OHP+PPC组中L-OHP及PPC剂量及注射方法分别同L-OHP组及PPC组，同一天联合用药时，上午给予PPC，中间间隔4～6小时，下午给予L-OHP。给药期间每天观察裸鼠的精神、饮食、活动等一般情况。21天后处死，剥离肿瘤组织，记录肿瘤体积和抑瘤率，观察给药后不同分组肿瘤的增殖是否有影响，分析PPC对L-OHP抗肿瘤活性的影响。

1.4 检测指标

自首次给药起，用游标卡尺每3天测量一次移植瘤大小，记录其长径(a)和短径(b)，并计算肿瘤体积=(ab2)/2[4]。以时间为横坐标、肿瘤体积为纵坐标绘制移植瘤生长曲线，停药后1周用颈椎脱臼法处死裸鼠后剥离肿瘤组织，计算体积抑瘤率，抑瘤率(瘤体积)=(对照组平均瘤体积-实验组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100%。取出的裸鼠肿瘤组织于-80℃冰箱保存备检。

1.5 RNA分离和qRT-PCR

用TRIzol试剂提取新鲜冷冻的4组裸鼠移植瘤肿瘤组织的总RNA。并按照试剂盒说明书对其进行qRT-PCR扩增，以GAPDH作为内参。将引物和SYBR Premix Ex Taq II加入到20 μL最终反应体系中。分别读取各个标本的待测基因与内参基因的Ct值。实时定量PCR在Applied Biosystems7500系统上进行。所有样品一式三份进行测试，所用引物序列详见表1。

表1 mRNA引物列表

1.6 蛋白质的提取、浓度含量的测定及Western blot分析

取4组移植瘤组织，每组约200 mg，将其加入蛋白裂解液，并组织匀浆，高速低温离心后收集裂解物(4℃12 000 g，5 min)。使用增强型BCA蛋白质测定试剂盒根据Broadford蛋白质测定试剂盒确定蛋白质的浓度。

将等量的每种样品的蛋白质(50 μg)在10%SDS-PAGE凝胶上电泳。然后将蛋白质在300 mA，1.5 h条件下转移至PVDF膜。用5%脱脂牛奶在室温(RT)下将含有蛋白质的膜在含有1%Tween-20的TBS中封闭2 h。一抗在4℃孵育过夜。洗涤膜3次，每次10 min，用封闭液稀释相应的HRP标记二抗-1∶50 000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2 h。以相同的方式洗涤膜。TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次，然后通过使用Bio-Rad GelDoc XR凝胶文献系统的SuperEnhanced化学发光检测试剂盒检测信号显色曝光。用ImageJ软件分析胶片灰度值。每个实验重复三次。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 裸鼠成瘤率及精神状态

接种10天以后，4组裸鼠均成瘤明显，成瘤率100%，移植瘤大小均介于5～8 mm之间，差异无统计学意义(P>0.05)，裸鼠移植瘤的生长呈膨胀性，未见明显转移灶出现，剥离瘤体可见包膜完整，边界清楚。给药期间，L-OHP组裸鼠进食量最少。PPC组和空白对照组裸鼠进食正常。

2.2 各组裸鼠移植瘤生长曲线

给药后，L-OHP+PPC组及L-OHP组的皮下移植瘤生长速度逐渐低于空白对照组及PPC组。用重复测量设计的方差分析，与空白对照组相比，PPC组未表现出明显的抗肿瘤作用，差异无统计学意义(P=0.39)，L-OHP+PPC组与L-OHP组相比，差异有统计学意义(P<0.001)(图1)。

图1 肿瘤生长曲线Figure 1 Tumor growth curveNote：*P<0.05，** P<0.01，***P<0.001，vs. the control group；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs. the L-OHP group.

2.3 各组移植瘤的瘤体积抑瘤率比较

移植瘤体积变化方面，与空白对照组相比，L-OHP+PPC组及L-OHP组表现出了明显的抗肿瘤作用，体积抑瘤率分别为52.72%、34.78%，析因设计方差分析结果显示PPC与L-OHP两药对肿瘤体积影响的交互作用有统计学意义(P=0.008)，PPC提高了L-OHP的抗肿瘤作用(表2，图2)。

表2 各组移植瘤的瘤体积抑瘤率比较

Note：***P<0.001，vs. control group；###P<0.001，vs. the L-OHP group.

图2 肿瘤大小的比较Figure 2 Comparison of tumor size in each group

2.4 荷瘤裸鼠肿瘤TLR4、Nanog、ABCF2的mRNA表达水平的改变

PPC与L-OHP两药对TLR4、Nanog、ABCF2的mRNA表达水平影响的交互作用均有统计学意义(TLR4：P<0.001；Nanog：P<0.001；ABCF2：P<0.001)，L-OHP+PPC组Nanog、TLR4、ABCF2的mRNA表达水平与空白对照组相比均显著降低，差异有统计学意义(TLR4：P<0.001；Nanog：P<0.001；ABCF2：P<0.001)，与L-OHP组相比均显著降低，差异有统计学意义(TLR4：P<0.001；Nanog：P<0.001；ABCF2：P<0.001)(表3，图3)。

表3 Real-time PCR中TLR4、Nanog、ABCF2基因的mRNA表达量

Note：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，vs. control group；###P<0.001，vs. L-OHP group.

图3 各组TLR4/Nanog/ABCF2基因mRNA表达差异Figure 3 The mRNA expression of TLR4/Nanog/ABCF2 gene in each groupNote：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 vs. control group；### P<0.001，vs. L-OHP group.

2.5 荷瘤裸鼠肿瘤TLR4、Nanog、ABCF2的蛋白表达水平的改变

在L-OHP+PPC组中TLR4、Nanog和ABCF2蛋白质的表达较L-OHP组降低，用析因设计的方差分析PPC与L-OHP两药有交互作用，PPC提高了L-OHP的抗肿瘤作用(TLR4：P=0.014；Nanog：P=0.01；ABCF2：P=0.015)(图4，图5)。

图4 Western blot检测4组蛋白的表达Figure 4 The expression of TLR4，Nanog，ABCF2 and β-actin in tumor tissues by Western blot

图5 Western blot检测4组蛋白的表达Figure 5 Statistical analysis of protein expression of Nanog，ABCF2 and TLR4 after standardized by β-actin in each groupNote：*P<0.05，**P<0.01，vs.the control group，###P<0.01，vs.the L-OHP group.

3 讨论

目前我国胃癌以中晚期常见，治疗胃癌的主要手段仍是全身化疗[2]。在以奥沙利铂为主的化疗方案中，铂类药物的耐药是影响化疗疗效的主要因素。在临床中化疗时往往出现肝功能的损伤，多烯磷脂酰胆碱是常用的保肝药物，其作用于肝细胞的细胞膜，影响细胞膜的完整性和流动性，减少细胞的氧化应激和炎症反应[5]。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)首次发现于黑腹果蝇中，作为一类突变基因致使果蝇胚胎发育异常[6]。以往的研究中TLRs最突出的生物学功能是在炎症方面的调控[7]。TLR4作为TLRs家族中一员，TLR4受体可激活肿瘤干细胞Nanog基因从而上调ABC家族蛋白表达[8]。Nanog在肿瘤中的表达与肿瘤分级、患者生存期密切相关，干扰Nanog基因的表达可显著抑制肿瘤的生长和转移[9-11]。Nanog基因表达在紫杉醇耐药的卵巢癌细胞中比亲代细胞表达显著增加。Fujii等[12]与Wang等[13]在人骨肉瘤、软组织肉瘤及尤文肉瘤组织中检测到Nanog基因的表达，提示Nanog基因的表达越高，化疗药物越容易耐药，化疗效果越差。ABCF转运蛋白是ABC转运蛋白超家族的一个亚组，ABCF1，ABCF2和ABCF3[14-15]。据报道它们涉及蛋白质翻译和延伸[14]。在耐顺铂的癌细胞系中鉴定出ABCF2基因扩增，表明ABCF2在调节顺铂耐药中的可能作用[16]。然而，目前的研究仅限于将ABCF2表达与不同肿瘤组织中的临床病理学特征相关联，但不能提供ABCF2显著影响顺铂耐药性的直接证据。

基于上述理论，本研究提出了多烯磷脂酰胆碱能否通过TLR4/Nanog/ABCF2基因影响胃癌细胞的耐药。多烯磷脂酰胆碱作用于肿瘤细胞后，不仅具有恢复细胞膜及细胞器膜正常功能等相关作用，还具有降低炎症反应，减少脂质过氧化及氧化应激等功能。多种细胞毒性药物如：奥沙利铂，主要通过主动转运的方式进入肿瘤细胞内部，进入细胞后可与肿瘤细胞内部的靶目标相结合从而发挥其抗肿瘤作用。而这些药物在细胞内聚集量及作用时间减少可能是由于肿瘤细胞膜流动性或者通透性降低，从而导致扩散减慢。多烯磷脂酰胆碱改善细胞膜的通透性及流动性，通过大量的清除氧自由基减轻对细胞膜的损害，从而达到恢复肿瘤细胞物质转移功能，进而提高奥沙利销在细胞内的累积量，提高奥沙利铂的抗肿瘤作用。而此次试验证明在多烯磷脂酰胆碱联合奥沙利铂作用在胃癌耐奥沙利铂细胞株(SGC-7901/L-OHP)的逆转耐药过程中，随着胃癌耐奥沙利铂细胞株(SGC-7901/L-OHP)移植瘤对奥沙利铂敏感性增强和抑瘤率的提高，TLR4/Nanog/ABCF2基因的mRNA和蛋白表达的降低，进一步表明TLR4/Nanog/ABCF2基因在胃癌耐药机制中发挥一定的作用。但TLR4/Nanog/ABCF2基因三者之间的关系及通路研究有待进一步证实。

本实验中L-OHP+PPC组奥沙利铂联合多烯磷脂酰胆碱作用于裸鼠移植瘤后能够明显抑制肿瘤发展，而且与L-OHP组相比，抑瘤率有明显提高。证明了与奥沙利铂联用时有交互作用，多烯磷脂酰胆碱明显提高了在胃癌耐药细胞株中奥沙利铂的抗肿瘤作用，起到了逆转肿瘤耐药的作用。在L-OHP+PPC组中，TLR4/Nanog/ABCF2三个基因的mRNA及蛋白的表达水平较空白对照组及L-OHP组有明显抑制。结合前期实验的结果，多烯磷脂酰胆碱与奥沙利铂可抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖和诱导细胞凋亡，且伴有Nanog及ABCF2基因表达的下降[3，17]。考虑多烯磷脂酰胆碱联合奥沙利铂作用于裸鼠移植瘤后可能通过降低TLR4、Nanog、ABCF2的mRNA及蛋白表达逆转人胃癌耐药细胞的耐药作用。在裸鼠体内实验中对于奥沙利铂的耐药机制及逆转机制有了更深一步的了解。为今后的进一步临床试验提供了有力的证据支持。