p53凋亡刺激蛋白2在HepG2.215细胞中通过抑制自噬来发挥抗乙型肝炎病毒的作用

刘东杰，纪 乐，刘 凯，陈德喜，吴 刚

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可以导致慢性乙型肝炎、多种肝脏疾病以及肝癌的发生,抑制HBV生存周期的某些重要环节成为控制HBV感染的重要手段[1]。最近有报道称HBV可以利用细胞自噬来促进自身复制和存活[2-4]。p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)可以对自噬产生抑制作用[5]。本研究将检测过表达ASPP2对HepG2.215细胞的自噬,以及对乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)和乙型肝炎E抗原(hepatitis Be antigen,HBeAg)表达的影响,从而揭示ASPP2是否可以通过抑制自噬来达到抗HBV的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2.215细胞、人ASPP2重组腺病毒(ASPP2 recombinant adenovirus,rAd-ASPP2)、对照腺病毒(rAd-vector)和GFP-LC3质粒来自北京市肝病研究所陈德喜教授实验室。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)购自美国SIGMA公司。DMEM培养基、胎牛血清和青链霉素购自美国Invitrogen 公司。 抗 LC3-Ⅰ/Ⅱ、Atg5、Atg14、Beclin-1、p62、β-actin和ASPP2抗体购自美国Abcam公司。HBeAg酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自广州健仑生物科技有限公司；HBsAg ELISA检测试剂盒购自上海纪宁生物科技有限公司。蛋白裂解液试剂盒、蛋白定量试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。聚偏二氟乙烯膜购自美国Bio-Rad公司。脱脂奶粉和RIPA裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司。化学发光底物试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物处理、腺病毒感染HepG2.215细胞用DMEM完全培养基(10%胎牛血清和1%青链霉素),在37℃,5%CO2孵箱中培养。3-MA用无菌去离子水配置。5 mmol/L的3-MA处理来抑制HepG2.215细胞的自噬,无菌去离子水为对照。rAd-ASPP2通过感染HepG2.215细胞来诱导ASPP2过表达,rAd-vector感染作为对照。

1.2.2 ELISA检测培养上清和细胞内HBsAg和HBeAg的水平 3-MA处理或rAd-ASPP2感染48 h后收集HepG2.215培养上清,细胞则用RIPA裂解液裂解,并将培养上清和细胞裂解液保存于-80℃。按ELISA检测试剂盒说明书检测培养上清和细胞裂解液中的HBsAg和HBeAg的水平。

1.2.3 免疫印记检测 收集HepG2.215细胞后用蛋白裂解试剂盒提取细胞总蛋白,并用蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。提取的总蛋白经沸水煮5 min变性,按30 μg/孔加样。经聚丙烯凝胶电泳分离(10%或15%的分离胶、5%浓缩胶)后,过夜转膜至聚偏二氟乙烯膜上。1×PBST洗膜后用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h,加入一抗(1∶1 000稀释)后4℃过夜孵育。1×PBST洗膜3次、每次5 min,再加入1∶5 000的二抗室温下孵育1 h。1×PBST洗膜3次,每次20 min。洗膜完成后膜上加上化学发光底物并曝光,曝光条带用凝胶成像系统采集。

1.2.4 转染实验 HepG2.215细胞消化并铺于爬片上培养24 h,待细胞汇合率达到80%以上时,用lipo2000转染GFP-LC3质粒,lipo2000与质粒比值为 1 μL∶2.5 μg。 转染6 h 后用1×PBS 洗3 次,并继续用DMEM完全培养基培养。

1.2.5 免疫荧光检测 HepG2.215细胞用1×PBS洗3次后,加入4%多聚甲醛室温下静置10 min后弃去多聚甲醛并用1×PBS洗3次。接着加入1%Triton X-100/PBS,室温下静置10 min后弃去Triton X-100/PBS,并用1×PBS洗3次。抠出爬片并用甘油封片。用荧光显微镜(Olympus DP71)检测绿色LC3-Ⅱ颗粒的表达。每个条件下对500个细胞中的LC3-Ⅱ颗粒进行计数。

1.2.6 免疫共沉淀检测 用蛋白提取试剂盒提取总蛋白后,总蛋白用蛋白A/G PLUS琼脂糖微球孵育后,接着加入抗ASPP2抗体并在4℃的条件下过夜孵育。被蛋白A/G琼脂糖微球拉下的免疫复合物用聚丙烯凝胶电泳进一步分离后,过夜转膜至聚偏二氟乙烯膜上。后续洗膜、一/二抗孵育及曝光检测同免疫印记。

1.3 统计学处理 应用Graphpad软件(5.0版),计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达ASPP2可明显抑制HepG2.215细胞的自噬 免疫印记结果显示rAd-ASPP2感染HepG2.215细胞可导致 ASPP2过表达(图1A)。ASPP2对细胞自噬有抑制和促进的作用[5-6]。本研究免疫荧光检测结果显示在HepG2.215细胞中,较之rAd-vector感染,rAd-ASPP2感染可明显下调绿色LC3-Ⅱ颗粒的水平(t＝8.578,P＜0.01)(图1B,图1C)。免疫印记结果显示ASPP2过表达导致LC3-Ⅱ/Ⅰ比例明显下调和p62水平明显上调(图1D)。以上结果表明在HepG2.215细胞中,ASPP2对自噬有抑制作用。但是ASPP2对Atg5、Atg14和Beclin-1等自噬相关蛋白的表达无明显影响(图1D)。因此,在HepG2.215细胞中ASPP2并非通过抑制以上自噬相关蛋白的表达来抑制自噬。

图1 ASPP2过表达可抑制HepG2.215细胞的自噬

2.2 ASPP2与Atg14结合抑制HepG2.215细胞的自噬 ASPP2通过与Atg5的结合来减少 Atg5-Atg12-Atg16复合物的形成,这使得自噬体膜延长被阻断从而抑制自噬[5]。本研究中,在HepG2.215细胞中,ASPP2被检测到可与Atg14结合,而与Atg5或Beclin-1之间未检测到结合(图2A)。免疫共沉淀结果显示促进ASPP2表达可明显增加它与Atg14的结合和抑制LC3-Ⅱ的表达；并且ASPP2表达越多,则它与Atg14的结合就越多、对自噬的抑制也越强(图2B)。最后,HepG2.215细胞感染rAd-ASPP2后,Atg14与ASPP2的结合可被检测到,但Atg14与Beclin-1的结合未被检测到(图2C)。Atg14被报道可与Beclin-1结合形成复合物而促进自噬体膜形成。因此,该结果表明ASPP2与Atg14结合导致Atg14不能与Beclin-1形成复合物,从而阻断自噬体膜的形成并最终抑制自噬发生。

图2 ASPP2与Atg14结合抑制HepG2.215细胞的自噬

2.3 抑制HepG2.215细胞自噬可明显降低HBsAg和HBeAg的水平 自噬抑制剂3-MA处理HepG2.215细胞后,LC3-Ⅱ/Ⅰ比例和p62的水平分别出现明显的下调和上调,结果表明3-MA明显抑制了自噬(图3A)。ELISA结果显示,较之试剂对照,3-MA处理导致培养上清中的HBsAg(t＝16.89,P＜0.001)和HBeAg(t＝6.249,P＜0.01)水平明显下调(图 3B,图3C)。ELISA结果也显示,较之试剂对照,3-MA处理导致 HepG2.215细胞内 HBsAg(t＝20.13,P＜0.001)和 HBeAg(t＝15.75,P＜0.001)的水平明显下调(图3D,图3E)。该结果表明抑制自噬可抑制HepG2.215细胞中HBsAg和HBeAg的表达。

2.4 过表达ASPP2可明显下调HBsAg和HBeAg的水平 HepG2.215细胞感染rAd-ASPP2或rAdvector(对照)后,ELISA检测结果显示,较之 rAdvector感染,rAd-ASPP2感染导致培养上清中的HB-sAg(t＝7.18,P＜0.01)和 HBeAg(t＝4.326,P＜0.05)水平明显下调(图4A,图4B)。ELISA检测结果也显示,较之rAd-vector感染,rAd-ASPP2感染导致HepG2.215细胞中的 HBsAg(t＝15.81,P＜0.001)和 HBeAg(t＝6.306,P＜0.05)水平明显下调(图4C,图4D)。该结果表明过表达ASPP2可抑制HBsAg和HBeAg的表达。

图3 抑制自噬对HBsAg和HBeAg表达的影响

图4 过表达ASPP2对HBsAg和HBeAg表达的影响

3 讨论

ASPP2是p53结合蛋白家族促凋亡成员,它通过与p53结合可促进p53对前凋亡基因的转录,因此它是一个抑瘤基因[7]。后来发现ASPP2对自噬具有抑制和促进两种作用。当ASPP2与Atg5结合后,它会抑制自噬体膜的延长而导致自噬的终止[5]。本研究则在小鼠肝癌细胞系Hep1-6上观察到ASPP2过表达可促进自噬发生,并且该自噬具有促凋亡作用(自噬性凋亡)[6]。ASPP2诱导自噬性凋亡与其促进损伤调节自噬调控因子表达有关,因为损伤调节自噬调控因子具有介导自噬性凋亡的能力[6]。本研究发现ASPP2过表达对HepG2.215细胞的自噬又展现出了抑制作用。虽然其分子机制还未被阐明,但是在HepG2.215细胞中ASPP2具有抑制HBV的能力,提示我们,ASPP2具有被开发成治疗HBV感染新方法的潜力。

自噬是细胞内的一种生命现象。正常生理情况下或应激(如营养剥夺导致的饥饿)时,胞浆内的双层膜结构(自噬体膜)包裹受损细胞器或冗余蛋白形成自噬体,自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体,溶酶体内的酶和酸性环境将自噬体包裹的细胞器或蛋白降解,降解产物被细胞再利用或用于产能[8]。因此生理情况下的自噬对细胞发挥一种保护作用,是一种重要的防御机制[8]。自噬体膜的形成处于自噬的早期阶段,其中Atg14和Beclin-1形成复合物是促进自噬体膜形成的关键。在HepG2.215细胞中,ASPP2与Atg14结合后可减少Atg14与Becxlin-1的结合,从而抑制自噬体膜的形成[9]。有研究发现ASPP2可以与Atg5结合并抑制自噬体膜的延长[5]。虽然本研究中,在HepG2.215细胞中ASPP2未被检测到可与Atg5结合、从而抑制自噬体膜延长,但是以上结果表明ASPP2对自噬的抑制效应可能主要是通过抑制自噬体膜来达到。

自噬除了发挥防御功能外,它还具有清除病原体感染的作用[10]。虽然HBV感染会诱导自噬,但该自噬不但不能促进HBV降解,反而病毒会利用自噬体膜作为自身DNA复制的场所而增加自身复制[2-4]。因此越来越多的文献认为自噬促进了HBV在胞内的持续存在,而抑制自噬则有利于对HBV的清除[10-12]。ASPP2正好具有抑制自噬体膜形成和延长的作用,并且ASPP2过表达也展现出具有抑制HBsAg和HBeAg产生的能力,提示ASPP2可能具有很好的抗HBV能力。到目前为止,ASPP2具有抗HBV能力的研究还未见报道,今后我们将继续研究ASPP2抗HBV的分子机制。

但是开发基于ASPP2的抗HBV感染的新方法,从理论上讲还是会有阻力,因为国内学者曾发现HBV的x蛋白表达会促进ASPP2基因的甲基化增加从而减少ASPP2的表达[13]。而ASPP2表达减少又将会导致自噬体膜形成和延长的增加,从而导致HBV复制增加。因此,ASPP2和HBV之间存在相互制约的关系,这种相互制约的分子机制还有待后续研究来阐明。

综上所述,ASPP2过表达具有抗HBV的作用,其机制与ASPP2结合Atg14而抑制自噬体膜形成有关。