-Gx加速度对家兔肺组织基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶抑制剂1水平的影响

韩 磊，李鸣皋，周家兴，陈宇亮，孙海文

近年来,-Gx加速度作用对于人体重要脏器功能的影响机制及其防护方面的研究日益受到广大到医学工作者的重视。有研究显示,模拟飞船返回过程中的较高G值水平的水平加速度作用可导致实验动物重要脏器如脑、心、肺等的损伤性改变[1]。而航母舰载机飞行员驾机在航母上阻拦着舰时,由于拦阻索的阻拦作用,飞行员也将受到水平方向的加速度载荷的作用,其对飞行员的心、肺等重要脏器的影响及其作用机制目前仍不十分清楚,有待于进一步研究。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9及其特异性抑制剂基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)1作为调节细胞外基质合成与降解的主要酶类,其与肺组织的炎症损伤、修复与重建过程有着密切的关系[2-4]。然而,既往关于水平加速度作用与MMP9及其抑制剂TIMP1之间关系的研究罕见报道。作者将就-Gx加速度作用对MMP9及TIMP1表达水平的影响进行研究,进而探索-Gx暴露对肺脏结构和功能的影响机制,为下一步舰载机飞行员心、肺功能的评价、训练与防护技术和标准的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 1月龄的雄性新西兰家兔20只,购自军事医学科学院实验动物中心(2017-0002)。丙酮(沪试10000418),中性树胶(上海标本模型厂),无水乙醇(振兴化工 XK13-011-0036),二甲苯(沪试100234192),Na2HPO4⋅12H2O(沪试 10020318),NaH2PO4⋅2H2O(沪试 20040718),柠檬酸(沪试10007118),免疫组化两步法试剂盒(博士德SV0001 SV0002),隔水式恒温培养箱(上海一恒 GHP-9050),电子天平(舜宇恒平仪器SOPTOP),电动震荡仪(大龙MX-E),恒温磁力搅拌器(新瑞仪器85-2),酸度计(雷磁 PHS-25),显微镜(奥林巴斯CX43)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 新西兰家兔购回后,先于动物房中饲养1周,以使其适应环境,然后随机分为对照组和实验组(-Gx加速度暴露组),每组10只。

1.2.2 -Gx加速度暴露 实验动物呈坐位垂直固定于座椅上,放置于动物舱中固定好,使动物面朝轨道运行方向。水平加速度作用条件为：加速度作用方向为由胸至背(-Gx),加速度作用峰值3.6 G,加速度作用时间为2 s。每只实验动物每天暴露20次,2次暴露之间间隔5 min,共计暴露30 d。对照组动物所有固定程序同暴露组,不进行水平加速度暴露。

1.2.3 标本留取 水平加速度暴露结束后,将实验组和对照组动物静脉注射空气处死,迅速留取肺脏组织标本。部分肺组织置于固定液中进行固定,部分肺组织置于冻存管中放入液氮罐中保存。

1.2.4 胶原含量的测定 染色液的配制：天狼猩红0.1 g,加入饱和100 mL的苦味酸溶液中,制成0.1%苦味酸-天狼猩红染色液。苦味酸-天狼猩红染色：①实验组和对照组的每个肺组织选取2张石蜡切片；②切片依次浸入二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；③经各级乙醇至水洗：→100%乙醇5 min→95%的乙醇5 min→85%乙醇3 min→75%乙醇2 min→蒸馏水洗1 min；④切片入苦味酸-天狼猩红染液中,染色1 h以上；⑤蒸馏水冲去多余的染色液,将切片入苏木精染液中常规复染；⑥切片依次入95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→无水乙醇(I)5 min→无水乙醇(Ⅱ)5 min；⑦切片依次入二甲苯(I)1 min→二甲苯(Ⅱ)1 min；⑧中性树脂封片,晾干备用。

切片于显微镜下观察,采用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统对结果进行分析,经标准灰度校正后,在高倍镜下随机取5个不重叠的视野计算胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF),并计算其平均灰度值。其中,CVF＝胶原面积/全视野面积×100%。每个标本2张切片的CVF的平均值作为该样本胶原容积分数值。在偏振光显微镜下观察Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量情况,用图像分析软件计算各组样本Ⅰ/Ⅲ胶原比值。

1.2.5 MMP9和TIMP1含量的测定 ①包埋好的肺组织标本用切片机进行切片,切片厚度为4 μm；②将切片置于烘箱中,60℃条件下烘片1 h；③将烘好的切片依次置于二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)溶液中脱蜡10 min；④将切片依次置于梯度乙醇中进行复水,具体步骤如下：100%乙醇5 min,100%乙醇5 min,95%乙醇5 min,80%乙醇5 min,蒸馏水冲洗5 min；⑤将切片置于0.1 mol/L且pH＝6.0的枸橼酸液修复液中,沸水浴20 min,停止加热后自然冷却20～30 min；⑥切片置于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)中,于摇床上清洗切片,每次3 min,共3次；⑦切片于双氧水中孵育20 min；⑧用PBS溶液清洗切片,每次3 min,共3次；⑨血清中封闭1 h；⑩切片晾干后,分别滴加MMP9(1∶500)和TIMP1(1∶500)一抗,于湿盒中 4 ℃下孵育过夜；○11切片置于PBS溶液中,于摇床上清洗切片,每次3 min,共5次；○12切片晾干后滴加二抗于切片上,在室温条件下孵育1 h；○13于摇床上用PBS溶液摇动清洗切片,每次3 min,共5次,待切片晾干后,滴加二氨基联苯胺溶液进行染色,然后用清水冲洗；○14用苏木素染核5 min,用流水冲洗多余的苏木素,再置于分化液中分化1 s；○15将切片于流水中冲洗5 min,依次进行梯度乙醇脱水,具体步骤如下：80%乙醇5 min,95%乙醇5 min,100%乙醇5 min,100%乙醇5 min；○16将切片依次入二甲苯(Ⅱ)透明5 min,二甲苯(Ⅰ)透明5 min,用中性树胶封片,晾干后备用。

在显微镜下进行观察,并对结果进行统计。统计计数时,对照组和实验组每只动物随机选取3张切片,每张切片在高倍镜下随机选取10个高倍镜视野,计数每个高倍镜视野内的阳性细胞数,将10个视野内的阳性细胞数的均数作为该切片的染色阳性细胞数,分别计算对照组和实验组各样本阳性细胞数。

1.3 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较用独立样本t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 -Gx加速度作用对家兔肺组织MMP9含量的影响 MMP9表达阳性的细胞主要表现为细胞浆呈现出棕色或者黄色的染色结果(图1)。与对照组相比,实验组动物肺组织MMP9蛋白表达水平显著增高(P＜0.05,表1),提示水平加速度作用对实验动物肺组织MMP9的表达有着显著的影响。

图1 2组家兔肺组织MMP9表达情况

表1 -Gx加速度对2组家兔肺组织MMP9含量的影响(±s)

表1 -Gx加速度对2组家兔肺组织MMP9含量的影响(±s)

注：对照组比较,∗P＜0.05

组别 MMP9对照组(n＝10) 13.7±7.2实验组(n＝10) 28.3±12.5∗

2.2 -Gx加速度作用对家兔肺组织TIMP1含量的影响 TIMP1表达阳性的细胞主要表现为细胞浆呈现出棕色或者黄色的染色结果(图2)。与对照组相比,实验组动物肺组织TIMP1蛋白表达水平显著降低(P＜0.05,表2),提示水平加速度作用对实验动物肺组织TIMP1的表达有着显著的影响。

图2 2组家兔肺组织TIMP1表达情况

表2 -Gx加速度对2组家兔肺组织TIMP1含量的影响(±s)

表2 -Gx加速度对2组家兔肺组织TIMP1含量的影响(±s)

注：对照组比较,∗P＜0.05

组别 TIMP1对照组(n＝10) 17.4±10.2实验组(n＝10) 8.6±5.9∗

3 讨论

MMPs是细胞外基质降解所必需的、锌离子依赖性的蛋白酶家族,为细胞外基质的主要调控因素,在细胞外基质合成与降解的过程中有着非常重要的作用[5-6]。MMP9又称明胶酶B,可由单核-巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞、纤维母细胞等合成和分泌,其在调控炎症反应、维持组织的正常结构、组织损伤后的修复及促进多种细胞因子的表达等方面均有着重要意义[7]。对MMP9表达的调控主要在转录、酶原的激活及其抑制物TIMP1等几个方面进行。多种炎性细胞因子,如白细胞介素(interleukin,IL)-1β、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-α、TGF-β1、IL-1α、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等可促进MMP9的表达。研究表明[8-12],作为MMPs中的重要一员,MMP9在细胞外基质的重塑中有着重要的作用,在肺间质纤维化、肺气肿、心室重构、动脉粥样硬化、缺血-再灌注损伤、心力衰竭等多种疾病的病理过程中扮演着关键的角色。MMP9可降解细胞外基质中的胶原成分,导致细胞外基质的退行性变,造成组织细胞排列紊乱、功能障碍。MMP9 还能促进 TNF-α、TGF-β、IL-1β 等炎性细胞因子的表达水平上调,促进心、肺、肾等组织中胶原、纤维粘连蛋白等基因的转录,进而使得胶原合成增加和在间质的沉积,损害心、肺、肾等脏器功能；而这反过来又会促进MMPs的表达水平上调,形成恶性循环,进一步加重心、肺等组织结构重构和功能的障碍。本研究发现,实验组动物心脏和肺组织的MMP9蛋白表达水平较对照组显著增加,这一结果提示一方面水平加速度暴露可导致实验动物心、肺等脏器MMP9表达水平的增高；另一方面水平加速度所导致的MMP9增高可能与其造成心、肺等脏器损伤的发生、发展有关。其机制可能与MMP9水平增高导致心肌间质成分改变、胶原含量和比例变化以及炎性因素等有关。

TIMPs是MMPs的内源性、特异性、天然性抑制剂。TIMPs与已激活的MMPs呈1∶1结合,与具有生物活性的MMPs非共价结合,与不具有生物活性的MMPs紧密结合呈复合物形式,如此不可逆的结合抑制了MMPs的活性。TIMPs在体内分布广泛,迄今已经发现的TIMPs家族有4种：TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。研究表明[13],TIMPs除具有特异性地抑制MMPs外,还具有调控细胞增殖、凋亡等功能,从而保持体内的动态平衡。不同TIMPs对MMPs家族成员的抑制作用具有特异性。对MMP9有特异性亲和力的是TIMP1,TIMP1主要来自于肺泡巨噬细胞及上皮细胞,是所有家族中活性最强的,其主要抑制功能是通过活化MMP9的锌离子活性中心与氨基酸功能区的半胱氨酸残基相结合,从而阻断MMP9与基底物的结合,减少细胞外基质的降解,是体内抑制、调节MMP9最主要的因素,从而对疾病进展也可以发挥作用。生理情况下,在细胞基底膜保持完整的前提条件下,MMP9在机体中处于低活性状态,与TIMP1保持动态平衡,当受到病理刺激时,导致细胞基底膜代谢紊乱,平衡被打破,出现一系列病理生理反应[14-15]。

本研究中,实验组动物肺脏TIMP1蛋白的表达水平较对照组明显降低,而其MMP9表达水平则显著增高。这一结果提示水平加速度暴露导致的MMP9表达水平增高可能与其作用下TIMP1的表达受到抑制有关。结合在本研究中发现的水平加速度暴露导致的实验组动物心脏胶原含量增高和胶原比例变化,提示水平加速度暴露引起的MMP9/TIMP1平衡破坏,从而使得心、肺等脏器细胞间质含量和成分改变,可能是加速度载荷对心、肺功能影响的作用机制之一。而关于水平加速度暴露导致实验动物肺脏MMP9和TIMP1蛋白表达水平改变的具体机制,目前尚不清楚。在下一步研究中,我们将就此继续加以探索。