壳寡糖-槲皮素聚合物的制备及体外抗人子宫内膜癌作用的研究

吴 愚，林佳颖，王未来，刘正芸，勾 英，张能英，罗 果，王 欢

子宫内膜癌是高发的女性恶性肿瘤之一,其致病因素不明,绝经后女性的发病率较高[1]。早期患者以手术治疗为主,晚期患者采用手术、放疗和化疗相结合的综合治疗手段。手术治疗不但复发转移率高,且对于年轻的患者而言,手术切除会降低雌激素,引起绝经期症状。虽然化疗有一定的疗效,但由于化疗的副作用明显,很少单独应用于子宫内膜癌的治疗[2]。所以对于子宫内膜癌,目前亟待全新的药物与治疗方法。

槲皮素是植物界分布广泛的多酚类化合物[3]。研究表明,槲皮素抑制肿瘤生长及诱导肿瘤细胞凋亡的作用,与它能够清除氧自由基、抑制癌基因表达、阻止癌细胞的扩散有关[4-8],而且槲皮素还能在诱导肿瘤细胞凋亡的同时,减少活性氧自由基的生成,保护正常细胞[9-10]。由于槲皮素难溶于水,吸收困难,所以众多研究者对其结构进行修饰,以改善槲皮素的溶解性而以利于肿瘤治疗[11-12]。壳寡糖是壳聚糖通过降解而形成良好的水溶性产物。壳寡糖含有多种活性官能团[13],能与肿瘤细胞表面的受体连接,打开肿瘤细胞膜,有效运载药物,发挥抗肿瘤作用[14-15]。

本研究通过改善槲皮素的结构,合成壳寡糖-槲皮素聚合物,研究该聚合物的溶解度及其在体外对子宫内膜癌细胞的抗肿瘤作用,为该聚合物用于子宫内膜癌的治疗提供实验数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人子宫内膜癌细胞(JEC)、人正常肝细胞(LO2),本实验室保存。

1.1.2 试剂 壳寡糖由大连中科格莱科生物公司(依托中国科学院大连化学物理研究所)惠赠；槲皮素(用无水乙醇配制成终浓度0.001 mg/mL)购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、50%戊二醛(用去离子水配制成终浓度1%)均购自成都市科龙化工试剂厂。

1.1.3 仪器 电子扫描显微镜(德国Carl Zeiss Jena公司)；红外光谱仪(德国Bruker Optics公司)；紫外光谱仪(美国Thermo公司)；酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 制备壳寡糖-槲皮素聚合物 聚合物制备流程见图1。

图1 壳寡糖-槲皮素聚合物制备流程图

1.2.2 壳寡糖-槲皮素聚合物的鉴定

1.2.2.1 扫描电镜观察形貌 取制备的壳寡糖-槲皮素聚合物(简称聚合物)0.01 g,干燥后用导电性好的粘合剂粘在金属样品台上,放在真空蒸发器中喷镀一层50～300 A的金属膜,在扫描电镜下观察,加速电压5 kV。

1.2.2.2 红外光谱仪分析 取制备的聚合物0.01 g,将其溶解后,制成KBr窗片,用红外光谱仪扫描。

1.2.2.3 紫外光谱仪分析 取制备的聚合物按1∶4的体积溶于去离子水中,取4 mL液体加入比色杯中,进行紫外光谱分析。

1.2.3 聚合物实验溶解性分析 称量槲皮素0.05 g配成3.33 mg/mL的槲皮素乙醇溶液,并取5 mL的3.33 mg/mL槲皮素乙醇溶液加入5 mL去离子水定容,再与去离子水混合,配制成17.75 mg/L、35.50 mg/L、71.00 mg/L、142.00 mg/L、284.00 mg/L,去离子水为空白对照,依次取0.1 mL加入96孔板中,得槲皮素系列质量浓度标准溶液。在373 nm波长处测定一系列溶液的吸光度,并对槲皮素质量浓度进行线性回归,得到方程y＝0.0067x+0.1284(R2＝0.995,x为溶液浓度,y为吸光度)。

取1 mL槲皮素乙醇溶液(3.33 mg/mL)与5 mL去离子水混合,不断加入1 mL去离子水,直到槲皮素析出,取0.1 mL加入96孔板,373 nm波长下测出吸光度,测量3次结果,代入标准曲线方程求出槲皮素的表观溶解浓度。

取0.017 mg/mL壳寡糖20 mL与0.001 mg/mL槲皮素5 mL混合,不断加入1 mL去离子水,直到槲皮素析出,取0.1 mL加入96孔板,373 nm波长下测出吸光度,测量3次结果,代入标准曲线方程求出表观溶解度。

取聚合物固体加入1 mL去离子水中,再逐渐加入聚合物固体,直至饱和状态。每组取0.1 mL加入96孔板,373 nm波长下测出吸光度,测量3次结果,代入标准曲线方程求出表观溶解度。

1.2.4 JEC和LO2细胞的培养 将JEC及LO2细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养,培养液为RPMI1640(含10%胎牛血清),用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.5 聚合物对肿瘤细胞(JEC)和正常细胞(LO2)增殖的影响

1.2.5.1 单独用药组 分为阴性对照组、阳性药物(顺铂)对照组以及聚合物组。药物浓度分别为3.33 mg/L、6.67 mg/L、10.00 mg/L、13.33 mg/L 和16.67 mg/L。

1.2.5.2 联合用药组 分组如下：①阴性对照组；②聚合物作用2 h后联用顺铂组(J+S)；③顺铂作用2 h后联用聚合物组(S+J),用药浓度为3.33 mg/L、6.67 mg/L、10.00 mg/L、13.33 mg/L 和 16.67 mg/L。增殖实验采用四氮唑蓝比色分析法(methythiazolyl-tetrazolium,MTT),在吸收波长490 nm下测定各组细胞的OD值,计算存活率(%)及抑制率(%),存活率(%)＝用药组OD值/阴性对照组OD值,抑制率(%)＝1-存活率(%)。

1.2.6 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 聚合物的鉴定 扫描电镜分析显示：单独的壳寡糖为球状(图2A),单独的槲皮素为方块状(图2B),磁力搅拌合成的聚合物为不规则团块状(图2C)。由此可判断方块状的槲皮素被其它物体覆盖,形成不规则的形状。

图2 扫描电镜图

红外光谱仪扫描结果：在3 306.81～2 929.44 cm-1波数、1 632.71～1 028.26 cm-1波数出现苯环结构上的特有吸收峰位(图3)。

图3 壳寡糖-槲皮素聚合物红外光谱图

紫外光谱仪扫描结果：聚合物中槲皮素紫外特征吸收峰为363 nm(图4A),而单独的槲皮素紫外特征吸收峰为374 nm(图4B)。它们的最大吸收波长相差11 nm,并且聚合物中的槲皮素发生蓝移,说明产生新的物质。

图4 紫外光谱图

综上结果,可得出壳寡糖已连接上槲皮素。

2.2 聚合物在水中溶解性测定结果 槲皮素在水中的表观溶解度低于聚合物在水中的溶解度(P＜0.05),也低于壳寡糖与槲皮素混合物的溶解度(P＜0.05),表 1。

表1 槲皮素及壳寡糖-槲皮素混合液和聚合物在水中的溶解度(±s)

表1 槲皮素及壳寡糖-槲皮素混合液和聚合物在水中的溶解度(±s)

注：与槲皮素组比较,∗P＜0.05

样 品 表观溶解度1 2 3平均值(±s)槲皮素 45.63 62.08 45.23 47.65±3.85壳寡糖-槲皮素混合溶液 173.14 144.93 163.79 160.62±14.37∗壳寡糖-槲皮素聚合物 276.08 307.23 298.58 293.96±16.08∗

2.3 聚合物对肿瘤细胞(JEC)和正常细胞(LO2)增殖的影响 MTT结果显示：聚合物各个浓度组,对JEC细胞的增殖均有抑制作用(P＜0.05),但毒性作用不及顺铂(图5A)；顺铂对LO2细胞的增殖有明显的抑制作用(P＜0.05),而各浓度组的聚合物对LO2细胞均无抑制作用(P＜0.05,图5B)。

图5 聚合物对正常细胞(LO2)和肿瘤细胞(JEC)增殖的影响(单独用药)

2.4 聚合物与顺铂的联用顺序对肿瘤细胞(JEC)和正常细胞(LO2)增殖的影响 MTT结果显示,先加顺铂后加聚合物(S+J)除了在浓度为3.33 mg/L未能产生毒性作用(P＞0.05),其余浓度保持着抑制JEC细胞增殖的作用(P＜0.05),但此组未对LO2细胞产生毒性(P＝0.054,图6A)；先加聚合物后加顺铂(J+S)保持着抑制JEC细胞增殖的作用(P＜0.05),还对LO2细胞增殖产生一定抑制作用(P＜0.05,图 6B)。

图6 聚合物对正常细胞(LO2)和肿瘤细胞(JEC)增殖的影响(联合用药)

3 讨论

壳寡糖是具有抗真菌和病毒活性的聚糖衍生物[16],过往研究者多选取聚糖作为包封材料,但是聚糖分子量大,水溶性不及壳寡糖[17]。并且,选取聚糖用作包封物合成方法较为复杂,目的是形成糖-脂质-包裹物的脂质体[18]。而本研究采取简化的磁力搅拌,形成糖-包裹物聚合物,以库伦力、氢键及羟醛缩合的三层动力,达到壳寡糖包裹槲皮素的目的。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物,它能调控细胞信号通路,诱导肿瘤细胞周期停滞,促进凋亡,抑制肿瘤细胞内耐药基因编码的糖蛋白表达及其活性,逆转肿瘤细胞的耐药作用[19]。本研究通过扫描电镜下表征、红外光谱仪测量、紫外光谱仪测量及溶解性分析,不仅证明得到目标聚合物,而且目标聚合物有良好的亲水性。

MTT法测定聚合物对细胞增殖的影响,聚合物单独使用时,各个浓度组均对JEC细胞产生抑制作用。用于LO2细胞时,在一定浓度下,表现出对LO2细胞的生长促进作用。原因可能是高浓度的聚合物以团聚的方式,造成壳寡糖包裹层过厚,细胞在胞吞聚合物时,释放槲皮素比较缓慢。联合用药时,先加顺铂后加聚合物、先加聚合物后加顺铂组对JEC及LO2的毒性都低于顺铂单独用药组,先加顺铂后加聚合物时,顺铂对JEC和LO2细胞产生抑制作用,后加入的聚合物对顺铂产生干扰作用,可能是聚合物中槲皮素的部分基团与顺铂中的金属络合物发生化学反应,致使抑制JEC的作用低于单独应用的顺铂效果,也导致对LO2细胞未产生明显的抑制作用。先加聚合物后加顺铂时,聚合物虽然能起到抑制JEC生长和促进LO2细胞生长,阻挡一部分顺铂接触细胞,屏蔽顺铂发挥过强的毒性作用,但是这也导致对JEC抑制率降低,而未被细胞吞噬的聚合物,又不能完全释放槲皮素与顺铂发生反应,导致部分顺铂进入正常细胞,发挥对LO2细胞的抑制作用。

未来,通过包裹材料运载药物抗肿瘤治疗将会成为医学科研的重点发展方向。包裹聚合物的尺度也将不断从分子化缩小为纳米化,并且灵敏度和准确度也会提高,肿瘤的治疗效果及患者的生存质量将会得到改善。本研究初步完成分子化尺度的运载药物,证明目标聚合物抗肿瘤真实有效,后续将以缩小尺度为目标,继续深入研究。