离体颈动脉窦-窦神经标本灌流与记录一体化装置的制备

刘 萍 辛 方 张思韬 黄海霞 王 伟 赵海燕

(1.首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京 100069；2. 首都医科大学燕京医学院机能教研室，北京 101300)

动脉窦压力感受器是减压反射的第一个环节，主要作用是将血压变化时对血管的牵张刺激转变为可向中枢传导的电信号，即机-电换能作用[1]。然而颈动脉窦压力感受器的机电换能作用的诸多细节并不清楚。目前器官水平研究动脉压力感受器功能的方法有两种：一种是在体隔离灌流的方法，实验时隔离颈动脉窦，钳制颈动脉窦内压力，同时记录动脉血压变化，进而测定出压力感受器的功能曲线[2]，另一种方法则是采用离体制备颈动脉窦-窦神经标本，直接观察颈动脉窦内压力变化对窦神经放电的影响[3]。相对于前一种在体隔离灌流的方法，后一种方法由于减少了其他神经体液因素对血压的影响，实验结果更能反映压力感受器本身的功能。本课题组经过多年的摸索，研制了一套离体颈动脉窦-窦神经标本灌流与记录一体化装置，实现了对离体颈动脉窦-窦神经标本血管内外灌流的同时控制窦内压力并同步记录窦神经放电。

1 材料与方法

1.1 离体颈动脉窦-窦神经标本的制备

实验采用成年家兔，体质量1.9～2.7 kg，雌雄不拘。20%(质量分数)氨基甲酸乙酯(5 mL/kg)静脉麻醉，安置气管插管。游离颈动脉窦区域和窦神经，最后取出的颈动脉窦-窦神经(carotid sinus-sinus nerve， CS-SN)标本，包括颈总动脉(长约7 mm)、颈外动脉(长约5 mm)、颈内动脉(长约5 mm，结扎)和窦神经(长约7 mm)。

1.2 标本槽的制备与标本的固定

利用有机玻璃板自制标本槽(图1)，标本槽包括血管槽(图1a)和神经槽(图1b)两部分，整个标本槽被固定在保温盒中。神经槽和血管槽之间被一块有机玻璃板(图1j，厚0.5 mm)分隔开，隔板上有一窄缝(图1k，宽0.5 mm)，为两槽间唯一相通的部位。血管槽内两侧各预置1根不锈钢插管(外径1.5 mm)， 分别与标本的颈总动脉端(图1n)和颈外动脉端连接(图1o)，由电气比例调节阀推动的灌流液，经一侧不锈钢插管进入颈总动脉到达颈动脉窦区和颈外动脉，再经另一侧不锈钢插管流出，此为血管内(窦内)灌流的途径。标本浸泡在血管槽内流动的生理溶液中，血管槽另有该液体的入口(图1e)和出口(图1f)，提供血管外灌流渠道。血管槽底部靠近隔板窄缝处(图1k)，置有一不锈钢丝电极(图1 m)，作为记录窦神经放电的参考电极。CS-SN标本的窦神经部分(图1g)经神经槽和血管槽间隔板的窄缝(图1k)进入神经槽。窄缝由硅酯密封，以隔绝两槽间液体的流动。在神经槽底部靠近窄缝(图1k)2 mm处，安置一个有机玻璃小立柱(图1i，直径1.5 mm，高2 mm)。一根不锈钢丝(直径0.1 mm，长20 mm)从神经槽底部向上穿过底板，并从小立柱中心穿出，不锈钢丝裸露部分长6 mm，悬于神经槽内，作为记录电极(图1h)。不锈钢丝另一端从神经槽底板下引出，与放大器输入端连接。神经槽内充石蜡油，覆盖窦神经。

1.3 灌流液、灌流方式及窦内压控制

灌流液成分： NaCl 154 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl22.2 mmol/L，MgCl21.1 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L；以HEPES-NaOH(5 mmol/L)调节pH值为7.4，持续以100% O2平衡，灌流液温度控制在 36～37 ℃。

实验时，同时对标本分别进行窦内和窦外灌流，两条途径灌流液相同。一路对标本表面(窦外)以 1 mL/min匀速灌流(图1f)，血管槽液体表面覆盖石蜡油；另一路则由压力调节阀输出的气压推动灌流液对窦内(血管内)进行脉动式灌流，该路灌流压由灌流液入口处的调节阀控制(图1q)，并由连于出口处的压力换能器(图1p)监测。

实验中应用计算机输出压力指令程序化控制压力调节阀(PRE-U，德国Hoerbiger公司)，该阀门进而控制高压纯氧(0.15 MPa) 的流量输出预定气压。此压力用于推动储液瓶中的灌流液进入血管(颈动脉窦内)内，同时钳制窦内压[4-5]。血管内灌流速度为 5 mL/min。血管内灌流液出口处安置压力换能器(YH-4，北京航天医学工程研究所)，用于记录窦内压。

2 结果

窦神经放电活动的记录：以单极记录法引导窦神经放电。 将制备好的颈动脉窦-窦神经标本如图1固定于标本槽内，窦神经从血管槽引至神经槽。应用硅酯将血管槽与神经槽间隔板窄缝封严，此为提高信噪比的关键。神经放电信号经前级(A1 402， 美国Axon instrument公司)、后级(CyberAmp380， 美国Axon instrument公司)放大和滤波，电压总增益为5 000倍，频带300 Hz～10 kHz。放大后的电信号和窦内压信号由数据采集系统(Digidata 1440， pClamp 10.0， 美国Axon instrument公司)采集(采样率为20 kHz)。颈动脉窦窦内压信号与放电信号同步记录。图2表示在一例家兔离体颈动脉窦-窦神经标本上记录的窦神经放电。在波动式和逐渐增加的斜坡式灌流压下，窦神经显现出与窦内压波动一致的规律性压力依赖性放电活动。

图1 灌流-记录槽结构示意图Fig.1 Schematic diagram of the perfusion and recording chamber

a： vessel perfusion chamber;b： sinus nerve recording chamber;c，d： entrance and exit of sinus perfusion fluid;e：exit of extravascular perfusion fluid；f： entrance of extravascular perfusion fluid；g： sinus nerve;h： recording electrode;i： an insulating column used to fix the recording electrode in sinus nerve recording chamber;j： a partition between vascular perfusion chamber and sinus nerve recording chamber;k： a narrow gap on the partition allowing sinus nerves to pass through and to be sealed by silicone esters;l： peristaltic pump;m： reference electrode at the bottom of the vessel perfusion chamber;n，o： the ends of the common carotid artery and the external carotid artery were connected to the stainless steel intubation respectively;p： pressure transducer;q： the control valve of the perfusion flow in the sinus;r： the control valve of the extra sinus perfusion flow. The vessel perfusion chamber and the sinus nerve recording chamber are fixed in a heat preservation chamber (not shown)， and the temperature is kept constantly by circulating fluid. The leads of the reference electrode and recording electrode are connected with the input of the amplifier through the bottom plate of the box (not shown).

3 讨论

通过离体灌流颈动脉窦-窦神经标本并控制颈动脉窦内压力，直接观察颈动脉窦内压力变化对窦神经放电的影响是器官水平研究颈动脉窦压力感受器的重要方法之一[6-8]。本课题组经过多年的摸索，研制的这套离体颈动脉窦-窦神经标本灌流与记录一体化装置利用一个带有小缝隙的薄有机玻璃板将标本槽分为血管槽和神经槽。实验过程中创造性的利用硅脂这种疏水又绝缘的膏状材料来封闭血管槽和神经槽间的缝隙，既保证窦神经能从血管槽通过缝隙进入神经槽，又能起到隔离血管槽和神经槽的作用，达到灌流和神经放电记录同步进行，互不干扰。同时，由于硅脂的疏水性，能避免血管槽中的灌流液渗入神经槽，有利于信号记录过程中信噪比的提高[9]。

图2 家兔离体颈动脉窦压力感受器放电活动Fig.2 Discharges of baroreceptor in isolated rabbit carotid sinus

The pressure-dependent discharges were recorded from a carotid sinus-sinus nerve specimen. The discharge activity originated from the baroreceptors according to the relationship between the discharge activity and the change of the pressure in the sinus.CSND： carotid sinus nerve discharge;ISP： intrasinus pressure;△1 mmHg=0.133 kPa.

在血管槽设置了两条灌流通路，能分别实现血管内、外灌流，便于了解药物发挥作用的部位。本装置可以在血管内灌流的出、入口分别安装窦内压力控制系统和压力记录装置，实验过程中可以控制窦内压力，并在记录窦内实际压力的同时记录窦神经放电，便于对窦内压力与窦神经放电间的关系进行研究[10]。本研究研制的这套离体颈动脉窦-窦神经标本灌流与记录一体化装置，可方便、可靠地实现对离体颈动脉窦-窦神经标本血管内外灌流，同时控制窦内压力并同步记录窦神经放电。这套系统对于研究血管压力感受器的功能具有重要的应用价值。