小鼠骨髓中性粒细胞分离纯化及活性检测研究

杨 琳 田 蕾 周 璇 杨 乐 李丽英

(首都医科大学细胞生物学系， ‘肝脏保护和再生调节’北京市重点实验室，北京 100069)

中性粒细胞是体内重要的固有免疫细胞，来源于骨髓中的造血干细胞，在骨髓中分化发育完毕后进入血液，参与炎性反应，有利于机体的免疫防御，但其参与的炎性反应也会对机体组织产生损伤[1-3]。中性粒细胞是循环系统中含量最丰富的白细胞，它不仅是机体防御外源病原体入侵的第一道防线，也是参与体内免疫调节的重要细胞[4]。当机体发生感染或者炎性反应时，中性粒细胞能够迅速迁移至炎性反应局部组织杀菌，完成了使命的中性粒细胞启动自发凋亡，保证一些具有细胞毒性的物质不会被随意地释放到组织中，引起不必要的组织损伤，最终凋亡的细胞被周围的巨噬细胞所吞噬清除[5]。故针对中性粒细胞的功能研究越来越受关注。但是，这一相关研究工作开展的前提是分离纯化出有活性的小鼠骨髓中性粒细胞。

目前文献[6-8]报道的分离人或动物的中性粒细胞的方法众多，常用的有密度梯度离心法、Dextran作用下红细胞自然沉降法、免疫磁珠等方法，Dextran作用下红细胞自然沉降法的回收率比较低，免疫磁珠分选的中性粒细胞存在一定的局限性。密度梯度离心法是根据细胞本身的比重差别来分离各种细胞的方法，其中最常用的是Percoll非连续密度梯度离心法，其原理是利用一种密度介于1.075～1.092 g/mL之间、且近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种细胞加以分离，但是该方法的试剂配制比较繁琐，而且分离得到的细胞形态与原始形态有差异[8]。

本课题拟优化分离纯化、鉴定及活性检测小鼠骨髓中性粒细胞的方法，根据细胞的密度不同的特点，加入Histopaque©-1077和Histopaque©-1119(两种市售的不同密度梯度的等渗溶液)来分离中性粒细胞，将收集的中性粒细胞加入抗Ly6G(中性粒细胞的标志蛋白)抗体孵育[9]，用高内涵筛选和分析仪检测，加入佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate， PMA)刺激后用高内涵筛选和分析仪鉴定其活性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1)动物：ICR小鼠(10只雄性)，SPF级，体质量28～30 g，5～6周龄，购于首都医科大学实验动物部，实验动物许可证号： SYXK(京)2015—0012。

2)主要仪器：离心机(德国 Eppendorf 公司 5810R)，细胞培养箱(150i，美国 Thermo 公司)，高内涵筛选和分析仪(Cell Insight,美国 Thermo Fisher 公司)。

3)主要试剂：Histopaque©-1077、Histopaque©-1119 (美国 Sigma 公司)， Ly6G 抗体 (美国 BD 公司)，髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗体(美国 Abcam 公司)，FITC羊抗兔抗体(美国 Jackson Immunoresearch 公司)，Cy3羊抗兔抗体(美国 Jackson Immunoresearch 公司)，DAPI(瑞士Roche 公司)，人纤连蛋白(美国Calbiochem 公司)，PMA(美国 Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓中性粒细胞分离纯化及活性检测流程

用Histopaque©-1077、Histopaque©-1119分离小鼠骨髓中性粒细胞流程图 (图1)。

1.2.2 小鼠中性粒细胞分离方法

脱臼处死ICR小鼠，无菌分离其胫骨和股骨，剥离结缔组织及肌肉，置于0.9%(质量分数)氯化钠注射液中，用直剪剪去骨头两端，暴露骨髓腔，用1 mL注射器(针规格 0.45×16)吸取0.9%(质量分数)氯化钠注射液冲洗骨髓腔，并将冲洗液用 70 μm 的尼龙滤网过滤到50 mL离心管中，1 200 g离心5 min收集细胞，用 3 mL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液重悬，将细胞悬液置于 9 mL Histopaque©-1077 上，4 ℃ 2 000 g无制动离心20 min，弃上清，用 5 mL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液重悬细胞，将细胞悬液置于10 mL Histopaque©-1119 上，4 ℃ 2 000 g无制动离心20 min，收集中间絮状层即为中性粒细胞。

1.2.3 小鼠中性粒细胞鉴定

将收集的细胞，加入等量0.9%(质量分数)氯化钠注射液，1 200 g 离心5 min用200 μL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液重悬细胞，加入200 μL 4%(质量分数) 多聚甲醛固定1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，0.5% PBST[含 0.5%(体积分数)Triton X-100 的 PBS]破膜 15 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用 2%(质量分数)BSA 37 ℃ 30 min，加兔抗 Ly6G(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加山羊抗兔FITC(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加DAPI(1∶100)5 min，加入到96孔板中用高内涵分析仪观察，拍片。

1.2.4 小鼠中性粒细胞活性检测

使用终浓度5 μg/cm2中人纤连蛋白(fibronectin)包被96孔板，将细胞悬液50 μL(105个)加到包被的板子上，37 ℃ CO2培养箱孵育4 h，将96孔板内的细胞采用数字表法随机分为实验组和对照组，实验组：加100 nmol/L PMA，对照组：加入与实验组中 PMA相同体积的1640 培养基，37 ℃ CO2培养箱孵育2 h，加入4%(质量分数)多聚甲醛固定1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，0.5%(体积分数) PBST破膜 15 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用2%(质量分数) BSA 37 ℃ 封闭30 min，加兔抗 MPO(1∶200)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加羊抗兔Cy3(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加DAPI(1∶100)5 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用高内涵分析仪10×物镜观察并拍片检测小鼠中性粒细胞MPO的表达情况。采用高内涵分析软件(美国Thermo Fisher公司)分析所获取的图像结果，实验重复3次，将3次结果取平均值进行倍数比较。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠中性粒细胞的鉴定

将分离纯化的细胞用免疫荧光的方法染色，采用高内涵分析仪检测观察中性粒细胞的标志物 Ly6G的表达情况。结果显示细胞 100% 表达 Ly6G (图2)，说明分离纯化的细胞是中性粒细胞。

图1 提取小鼠骨髓中性粒细胞流程图Fig.1 Scheme of mouse neutrophils from bone marrow

图2 小鼠骨髓中性粒细胞标志物的表达Fig.2 Ly6G were expressed in mouse neutrophils from bone marrow

Representative images of neutrophils Ly6G (green) were showed by immunofluorescence.Ly6G(-)：without Ly6G antibody; Ly6G(+)： with Ly6G antibody. Nuclei were stained with DAPI. High Content Screening(20×).

2.2 小鼠中性粒细胞活性的鉴定

用100 nmol/L PMA刺激，检测 MPO 的表达。结果显示加入PMA刺激后，中性粒细胞MPO表达增强，实验重复3次，单次检测结果详见图3A，用高内涵分析软件(Thermo Scientific Cellomics iDEV Software)分析所获取的图像，将3次的荧光强度取平均值进行倍数比较。实验组的荧光强度是9 052±1 039.16，对照组的荧光强度29 547.67±1 997.33，实验组是对照组的(3.26±0.22)倍(P<0.05)，详见图3B。

图3 小鼠骨髓中性粒细胞的活性鉴定Fig.3 MPO was expressed in mouse neutrophils from bone marrow

3 讨论

中性粒细胞被认为是最先募集到感染部位的免疫细胞，在固有免疫反应中扮演着重要的角色。中性粒细胞是宿主防御过程中的重要环节之一，它在组织器官中发挥着抵抗病原菌的作用，如在动脉粥样硬化、血管炎、血栓形成、肝损伤等多种疾病中均发挥着重要作用[10-15]。中性粒细胞和它引发的炎性反应在组织损伤过程中也有重要作用，所以中性粒细胞的研究也越来越受关注。本实验室近期研究关注中性粒细胞在小鼠纤维化模型中的作用，建立一种简单的分离纯化和活性鉴定中性粒细胞的方法是进行研究的第一步。Histopaque©-1077是淋巴细胞分离液，Histopaque©-1119是单个核细胞和粒细胞分离液，本实验是利用细胞本身的比重差别将二者一起使用来分离中性粒细胞。MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，又称髓过氧化物酶，外界刺激可导致中性粒细胞聚集释放MPO[16]，这是中性粒细胞发挥功能的主要方式之一，因此用 PMA 刺激提取的小鼠骨髓中性粒细胞，检测 MPO 的表达来鉴定小鼠中性粒细胞活性。与传统方法比较，本实验室采用的分离纯化的小鼠骨髓中性粒细胞活性以及功能、细胞纯度、分离纯化效率并未发生明显改变[17]，但是本分离方法简便易操作，试剂更规范化，能够有效地分离并鉴定出有活性的中性粒细胞，为进一步研究中性粒细胞在肝纤维化中的作用奠定基础。