精氨酸加压素对大鼠下丘脑 视前区AMPA受体GluR1- 3蛋白表达的影响

徐 润，孙燕泥，杨 冉，唐 恬，陈春月，阳明芳，付贤宁，宁 竣，陈灵燕，唐 瑜

(成都医学院 1.检验医学院；2.基础医学院；3.体温与炎症四川省高校重点实验室，四川 成都 610500)

精氨酸加压素(arginine vasopressin，AVP)是由下丘脑视上核和室旁核神经元合成的九肽激素，在体温调节中发挥重要的负调节作用[1]。中枢或外周给予AVP引起大鼠低温反应，而AVP V1a受体抑制剂使大鼠体温和棕色脂肪组织温度升高[1- 4]。下丘脑视前区(preoptic area，POA)分布的温度敏感神经元参与体温调节[5]。AVP通过激活V1a受体兴奋视前区热敏神经元，抑制冷敏神经元[6]。谷氨酸激活视前区α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid, AMPA)受体可以升高大鼠体温[7]，而阻断中枢谷氨酸促离子型受体，可以抑制外周注射AVP引起的低温反应[8]。在海马、外侧隔区、下丘脑室旁核和脑干等部位，AVP通过激活V1a受体抑制谷氨酸能突触传递[9]，但AVP是否影响视前区AMPA受体表达尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性SD大鼠，体质量200～250 g[成都达硕实验动物有限公司，合格证号SCXK(川)2015- 030]。

1.1.2 试剂：RNAlater和Trizol(Invitrogen公司)；DEPC(Sigma公司)。PrimeScript RT reagent Kit、FastStart Essential Probes Master(大连宝生物工程有限公司和Roche公司)；核酸染料4s red(生工生物工程股份有限公司)；TEMED、RIPA裂解液和PMSF(上海碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白含量检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；4×上样缓冲液(Bio-Rad公司)；蛋白Marker(Thermo Fisher公司)；ECL化学发光试剂盒(Millipore公司)；一抗GluR1、GluR2和GluR3(CST公司)；β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)(Abcam公司)。

1.1.3 探针与引物：荧光定量PCR检测目的基因所使用探针(Roche公司)，所需引物为该探针库所匹配的特异引物(表1)。引物由成都梓熙擎科生物技术公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分组及取材：将动物随机分成对照组、AVP组(10 μg/kg，腹腔注射)、阻断剂组(V1a受体抑制剂30 μg/kg，腹腔注射)和阻断剂+AVP组，每组均为4只大鼠。各组先注射0.9%氯化钠溶液(saline)或V1a受体抑制剂，20 min后再注射等体积0.9%氯化钠溶液或AVP，30 min后取材进行分子生物学实验。

表1 目的基因探针及引物序列Table 1 Probe and primer sequences of objective gene

腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，迅速开颅取完整脑，用DEPC处理过的冰PBS冲净血水。用振动切片机切成300 μm下丘脑片，在解剖显微镜下选取视前区组织，分别存放于装有1 mL RNAlater的离心管中。4 ℃过夜，-20 ℃保存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测mRNA含量：将保存于RNAlater的组织块用无酶镊子转移至1 mL Trizol中，严格参照Trizol试剂说明书操作，获得RNA样本后，使用微量紫外分光光度计测定RNA 浓度及纯度，A260/280≈2.0。1%甲醛变性琼脂糖凝胶上进行电泳检测RNA 完整性，可见明亮的28 S、18 S及较淡的5 S这3条带，无DNA 污染条带。随后冰上制备RT-PCR反应体系，首先去基因组DNA，反应体系为：5×gDNA Eraser 缓冲液 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，总RNA 2 μg，加无酶水至总体系为10 μL，混匀离心后转至PCR仪，42 ℃孵育2 min；然后在体系内加入10 μL的反转录预混液，该预混液含：PrimeScriptRT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL，RT Primer Mix 4 μL，5×PrimeScriptBuffer 24 μL，RNase Free dH2O 1 μL。混匀离心后在PCR仪内反应：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反转录所得cDNA用于荧光定量PCR，配置预混液比例为每10 μL反应体系含FastStart Essential Probes Master 5 μL，引物及探针各0.15 μL，RNase Free dH2O 1 μL，涡旋混匀后分装于八联管，加入2 μL cDNA模板，再次混匀离心后上机，扩增程序为95 ℃预变性10 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,读取荧光值，循环45次；最后40 ℃延伸30 s。反应结束后，以β-actin为内参，使用2-ΔΔCt法计算各组mRNA相对含量。

1.2.3 Western blot测定蛋白表达：取出组织块，于滤纸上吸干液体称重，按1 g∶5 mL加入裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，剪碎组织块，电动匀浆，置于冰上裂解30 min，随后4 ℃ 13 000×g离心10 min，取上清液至新的预冷的离心管中。严格按照BCA试剂说明书进行蛋白定量，以100 μg为标准分装样品，加入5 μL 4×上样缓冲液，最后用RO H2O补齐体积至20 μL，涡旋震荡混匀，100 ℃恒温加热10 min。将样品进行SDS-PAGE，使用4 ℃过夜的10%凝胶，电泳100 V 20 min，120 V 80 min；根据蛋白Marker指示，切下相应范围的胶条，转膜，4 ℃ 200 mA 90 min，5%脱脂奶粉37 ℃封闭5 min，一抗4 ℃震荡过夜(GluR1、GluR2和GluR3 1∶400，β-actin 1∶5 000)，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗(1∶5 000)37 ℃震荡2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，曝光。用凝胶成像分析系统分析结果，计算条带的积分光度值(IA)。结果以目的蛋白相对表达量表示，目的蛋白相对表达量=目的蛋白(IA)/内参(IA)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 AVP对大鼠视前区AMPA受体亚基mRNA表达的影响

腹腔注射AVP后，大鼠视前区AMPA受体GluR1、GluR2和GluR3 mRNA表达量与对照组相比无明显变化。V1a受体抑制剂使GluR2 mRNA表达量减少，而外源性AVP也没有削弱V1a受体抑制剂下调GluR2 mRNA表达的作用，这二组大鼠视前区GluR2 mRNA表达量明显降低于对照组(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with control group图1 AVP对大鼠视前区AMPA受体亚基mRNA表达的影响Fig 1 Effect of arginine vasopressin on the mRNA expression of AMPA receptor subunits in rat

2.2 AVP对大鼠视前区AMPA受体亚基蛋白表达的影响

与对照组相比，AVP显著降低了大鼠视前区AMPA受体GluR3蛋白表达，并使GluR1和GluR2蛋白表达量明显上升(P<0.01)。V1a受体抑制剂并未阻断AVP引起的GluR1和GluR2表达上调，GluR3表达减少(P<0.05)(图2A，B)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图2 AVP对大鼠视前区AMPA受体亚基蛋白 表达的影响Fig 2 Effect of arginine vasopressin on the protein expression of AMPA receptor subunits in rat

3 讨论

下丘脑视前区温度敏感神经元参与维持体温恒定，其放电受到突触传递的调控[10]。整体动物实验发现，外周注射AVP引起的低温反应与中枢谷氨酸促离子型受体的激活密切相关[8]。AMPA受体是中枢主要的谷氨酸促离子型受体，由GluR1- 4 4个亚基组成，其中GluR2在AMPA受体中的相对表达量决定了AMPA受体的功能特性[11]。GluR4通常在大鼠幼年期表达，在成年大鼠主要表达由GluR1- 3组成[12- 13]。

外周注射AVP引起的降温作用与减压反射抑制支配棕色脂肪组织的交感神经放电，减少产热有关[14]。但去除大鼠颈动脉窦后，并没有完全消除AVP的降温作用[2]。阻断中枢谷氨酸促离子型受体后，却可抑制腹腔注射AVP引起的低温反应[8]。本实验发现外源性AVP不影响GluR1- 3 mRNA表达，阻断内源性AVP后，只下调GluR2 mRNA。AMPA受体亚基蛋白变化与基因表达变化并不一致，外源性AVP增加GluR1和GluR2的蛋白表达，减少GluR3表达。可能是由于外源性AVP使GluR1和GluR2蛋白质翻译效率升高导致其mRNA表达出现下降趋势。AMPA受体胞内有PKC和CaMKII磷酸化位点[15]。V1a受体是Gq/11蛋白偶联受体，推测AVP激活V1a受体，通过PKC和CaMKII磷酸化AMPA受体，并调控靶基因的转录和翻译。本实验发现外源性AVP增加GluR1/2蛋白，可能是AVP引起GluR1 C端的磷酸化使AMPA受体在胞内贮积，间接导致GluR2蛋白水平上调；GluR1/2表达的增高又引起GluR3表达的减少，从而维持总AMPA受体亚基的平衡。V1a受体阻断剂并未完全阻断外源性AVP对AMPA受体亚基的作用。可能与腹腔注射的V1a受体抑制剂较难通过血脑屏障有关。激活视前区AMPA受体可以升高体温[7]，而AMPA受体中GluR2的相对表达决定了AMPA受体的功能特性[11]。推测AVP可能通过增加视前区神经元GluR2表达，使钙离子通透性降低，抑制AMPA受体功能，从而影响视前区温度敏感神经元的放电活动，引起低温反应。

综上所述，AVP主要通过影响AMPA受体GluR1- 3蛋白表达来减少视前区AMPA受体介导的谷氨酸能突触传递。这种对AMPA受体亚基表达的调控，为在整体动物实验上观察到的AVP对体温的调节作用提供了一种可能的中枢突触传递机制。