响应面优化乙酸酐改性蛋黄蛋白质工艺

李和平，魏建春，付 丽，王 斌

（河南牧业经济学院食品与生物工程工程学院，河南郑州 450011）

我国是禽蛋生产大国，年产量超3 000万t，约占全球禽蛋产量的45%[1]，拥有丰富的禽蛋加工资源。然而我国禽蛋加工业与发达国家相比，存在加工能力弱、加工深度低、品种单一等不足。禽蛋蛋黄中含有大量高附加值的活性物质，蛋黄蛋白质便是其中之一。蛋黄中蛋白质含量高、种类多、功能丰富，是一种传统的表面活性剂，在饲料、医药、化工、食品及保健品领域应用广泛[2]。目前，我国蛋黄分离加工主要以提取蛋黄油脂为主，生产过程中使用乙醇、甲醇及丙酮等有机溶剂造成分离加工后蛋黄蛋白质不同程度地变性，降低其营养价值和功能特性。

一般采用酶解、化学和物理方法对蛋白质进行改性以改善其功能特性。其中，化学改性由于操作简单、方便易行而成为蛋白质类改性研究的热点[3]。酰基化是一种反应条件温和、节约能源的化学改性方法，并因能够用来生产具有高乳化性、高溶解性及高起泡性等高附加值改性蛋白产品而日益受到重视。乙酰化改性植物蛋白如小麦面筋蛋白、花生蛋白、大豆分离蛋白和大米蛋白以及蛋黄体系中蛋白质的物理及酶改性研究报道较多[4-13]。迄今为止，利用乙酰化反应对蛋黄蛋白质改性的研究尚未见相关报道。本研究采用乙酸酐对蛋黄提取脂类后的蛋黄蛋白质进行改性，以乙酰化程度为评价指标，利用响应面法对乙酰化改性蛋黄蛋白质的工艺条件进行优化，并对改性后黄蛋白质的乳化性进行初步研究，为蛋黄蛋白质在饲料、医药、化工及保健品领域的工业化利用开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 鲜鸡蛋为市售褐壳蛋；乙酸酐为淄博鲁中化工轻工有限公司生产；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备 JJ-1A精密增力电动搅拌机（武汉格莱莫检测设备有限公司），WFZ-W2000型分光光度计（尤尼柯仪器有限公司），PHS-3E酸度计（上海雷磁仪器厂），LR10-24A 型离心机（北京雷勃尔有限公司），SHA-C恒温振荡水浴锅（常州金坛精达仪器制造有限公司），DHG-9204A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），R-501型旋转蒸发器（巩义市英峪高科仪器厂）。

1.3 蛋黄蛋白质的制备 参考赵绘绘等[14]的制备方法，取鸡蛋分离出蛋黄，蛋黄搅拌均匀后放入洁净的带塞的三角瓶中，加入95%乙醇（用量4.0 mL/g）浸泡、搅拌60 min 后，静置15 min，抽滤，滤饼用乙醇浸泡、抽滤，重复2 次。所得滤饼快速挥干即为蛋黄蛋白质。

1.4 乙酰化蛋黄蛋白质的制备方法 乙酰化蛋黄蛋白质的制备是根据张红印等[4]报道的方法，略做修改。取一定质量蛋黄蛋白质加入纯净水，搅拌30 min溶解后，用2 mol/L NaOH调节pH至8.0±0.5，恒温30℃下按一定速度分批缓慢加入乙酰酐，调节pH始终保持在8.0±0.5，反应一定时间后，用2 mol/L HCl调pH至4.0，3 500 r/min离心10 min收集沉淀，用蒸馏水将沉淀洗涤2次后快速挥干，粉碎至100目得改性蛋黄蛋白质。

1.5 乙酰化程度的测定 采用Paik等[15]的茚三酮比色法测定蛋白质的酰化程度。

1.6 蛋黄蛋白质乳化性的测定 参考李磊等[7]的方法测定乳化活性（EA/OD500）和乳化稳定性（ESI/min）。

1.7 单因素试验设计

1.7.1 蛋白质浓度（m/v）对乙酰化反应的影响 在浓度（m/v）为1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%的蛋黄蛋白液中分别加入蛋黄蛋白质量20%（v/m）的乙酸酐，在温度30℃、pH在8.0±0.5条件下反应100 min后，测定酰化程度。

1.7.2 乙酸酐添加量对乙酰化反应的影响 在8%（m/v）蛋黄蛋白液中分别加入占蛋黄蛋白质量的百分数（v/m）为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%的乙酸酐，在温度30℃、pH在（8.0±0.5）条件下反应100 min后，测定酰化程度。

1.7.3 反应时间对乙酰化反应的影响 在8%（m/v）蛋黄蛋白液中加入占蛋黄蛋白质量的百分数20%（v/m）的乙酸酐，在温度30℃、pH在8.0±0.5条件下分别反应 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min 后，测定酰化程度。

1.8 响应面实验设计 在单因素试验的基础上，选取反应时间、蛋黄蛋白质浓度（m/v）和乙酸酐添加量（v/m）3个因素设计响应面分析试验，因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素水平

1.9 统计分析 所有试验均重复3次，取其平均值。采用Excel软件进行数据处理。乙酸酐改性蛋黄蛋白质采用Design-Expert 8.0.6.1统计软件进行Box-Behnken中心组合试验设计和分析。

2 结果与分析

2.1 单一水解条件分析

2.1.1 蛋白质浓度对乙酰化反应的影响 从图1可以看出，当蛋白浓度从1%增加到8%时，乙酰化程度迅速上升；当蛋白浓度从8%增加到16%时，蛋黄蛋白的乙酰化程度开始降低。其原因是随着蛋白质浓度的增加，高浓度蛋白质分子与乙酸酐分子充分碰撞有利于乙酰化反应；但蛋白质浓度过高，溶液体系的粘度增大，蛋白质和乙酸酐分子的碰撞减少，最终导致蛋黄蛋白酰化程度降低[16]。因此，蛋黄蛋白质的最适浓度为8%。

图1 蛋白质浓度对乙酰化反应的影响

2.1.2 乙酸酐添加量对乙酰化反应的影响 从图2可以看出，当乙酸酐添加量从5%增加到20%时，乙酰化反应以较快的速度增加，蛋黄蛋白的乙酰化度迅速增加；当乙酸酐添加量超过20%后，乙酰化度增加不明显。随着乙酰酐浓度的增加，乙酸酐分子与蛋黄蛋白质分子碰撞机率增大，反应速率增加，产物乙酰化程度增加；但当乙酰酐达到一定浓度后，蛋黄蛋白参与酰化反应的基团达到饱和，乙酰化度不再明显增加[16]。因此，确定乙酸酐的最适添加量为20%。

图2 乙酸酐添加量对乙酰化反应的影响

2.1.3 反应时间对乙酰化反应的影响 由图3可知，当反应时间从10 min增加到50 min，乙酰化度迅速上升；当反应时间超过50 min之后，乙酰化度基本保持恒定[17-18]；乙酰化反应时间过长，不利于工业生产，确定乙酰化蛋黄蛋白质的最适反应时间为50 min。

图3 反应时间对乙酰化反应的影响

2.2 响应面优化试验结果及方差分析

2.2.1 响应面试验结果 响应面试验及结果见表2和表3。利用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2试验数据进行回归拟合，获得蛋黄蛋白质乙酰化度（Y）对反应时间（A）、蛋白质浓度（B）、乙酸酐添加量（C）的二次回归模型方程：Y=72.00+2.48A+2.62B+8.16C+0.88 AB+0.56AC-0.36BC-2.17A2-1.69B2-3.32C2。

如表3所示，回归模型的F值为22.184 9，P 值为0.000 2，达到极其显著水平；失拟项不显著（P=0.210 1），模型的确定系数R2=0.966 1，可以用该回归方程对乙酸酐改性蛋黄蛋白质的实际情况进行预测。从F值可知，3个因素对蛋黄蛋白质改性效果影响的顺序为C＞B＞A。一次项A、B、C对乙酰化反应效果影响极显著（P＜0.01）。AB、AC、BC交互作用对乙酰化反应效果影响不显著（P＞0.05）；二次项A2、B2对乙酰化反应效果影响不显著（P＞0.05），C2对乙酰化反应效果影响极显著（P＜0.01），说明各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

表2 响应面分析试验设计及结果

表3 各因素和回归方程的方差分析

2.2.2 响应面分析 等高线图可以直观反映各因素对乙酰化程度的交互作用程度[19]。从图4可以看出，反应时间和蛋白质浓度等高线图是椭圆形的，表明两者之间的相互作用明显；反应时间和乙酸酐添加量、乙酸酐添加量和蛋白质浓度等高线图的接近圆形，表明两者之间的交互作用不明显。比较图4各响应面曲线可知，在乙酸酐添加量方向的坡面较陡，随着乙酸酐添加量的增加，乙酰化度呈现逐步升高的趋势，并在乙酸酐添加量25.00%附近，乙酰化度最高，表明乙酸酐添加量对乙酰化度影响较为显著。蛋白质浓度次之，其曲线较平直。反应时间方向的坡面更平直，乙酰化度的升高趋势不明显，说明反应时间对蛋黄蛋白质乙酰化改性效果影响不显著。

图 4 各交互因素对乙酰化蛋黄蛋白质影响的响应面及等高线图

2.2.3 最佳工艺条件及验证 经Design-Expert 8.0.6.1分析得到的预测工艺条件为反应时间54.43 min、蛋白质浓度9.80%、乙酸酐添加量25.00%，预测乙酰化度为79.19%。根据实际操作，对工艺条件进行规范化处理，在反应时间55 min、蛋白质浓度10.00%、乙酸酐添加量25.00%条件下，做5次验证性试验，结果蛋黄蛋白质乙酰化度为78.98%，与预测理论值接近，说明此模型优化结果可靠。

2.3 蛋黄蛋白质的乳化性质测定结果 从表4可以看出，与未改性蛋黄蛋白质相比较，乙酰化后蛋黄蛋白质EA和ESI分别提高了67.16%和82.91%，这主要是因为酰化改变了蛋白质的结构，相邻分子间的离子键减弱，亲水性更强[20]。

表 4 蛋黄蛋白质的乳化性质

3 结 论

各因素对蛋黄蛋白质乙酰化度影响的顺序为乙酸酐添加量＞蛋白质浓度＞反应时间。乙酰化反应改性蛋黄蛋白质的最适佳工艺条件为反应时间55 min、蛋白质浓度10.00%、乙酸酐添加量25.00%，该条件下蛋黄蛋白质乙酰化度为78.98%，与预测值接近，且改性后蛋黄蛋白质的乳化活性和乳化稳定性分别提高了67.16%和82.91%。该研究结果将为乙酰化改性蛋黄蛋白质生产和应用提供参考。