中华猕猴桃根三萜类化合物双水相超声提取工艺及抗癌活性分析

赵红岩

中华猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.），又名藤梨、羊桃藤等，是中国特有的藤本果种，因其浑身布满细小绒毛，很象桃，而猕猴喜食，故有其名（李时珍《本草纲目》）。中华猕猴桃根又称藤梨根。藤梨根性寒、味苦，可清热解毒、活血消肿、祛风利湿，常用于风湿性关节炎、跌打损伤、丝虫病、肝炎、痢疾、淋巴结结核、痈疖肿毒、癌症等。现代研究表明，其根中含三萜类、黄酮类、蒽醌类、酚类及其他多种活性成分，其中以三萜类成分为主[1-2]。现代药理研究发现，猕猴桃根具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等药理作用[3-5]。

目前，国内对于植物中三萜类成分提取的方法主要有溶剂提取法、超临界CO2提取法、超声波提取法、双水相提取法等。溶剂提取法主要是利用有机溶剂对原料中的三萜成分回流提取，此提取方法简单方便、生产的一次性投入较低，但此过程中成分损失较大、周期长且提取效率较低。超临界CO2提取技术具有高效、安全、几乎无毒等特点，但其设备的一次性投入较大、生产技术工艺不够完善。超声波提取技术是利用超声波产生空穴效应增强细胞膜的通透性，将原料中的三萜成分提取到溶剂中，具有提取效率高、提取时间短、节能等优点，目前广泛应用于药物活性成分的提取领域。双水相萃取技术是利用物质在双水相体系中的选择性分配进行分离，此提取工艺具有设备简单、操作条件温和、高效安全等特点。试验采用双水相提取和超声波提取相结合的方法，采用正交试验法考查提取中性盐的质量浓度、有机溶剂体积分数、超声时间和料液比4个因素对中华猕猴桃根中三萜类化合物提取率的影响。同时，考查了三萜类提取物对3种肿瘤细胞的抑制活性。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

齐墩果酸标准品（纯度99.5%），中国药品生物检定所提供；香草醛、冰醋酸、异丙醇、硫酸铵、高氯酸，西安化学试剂厂提供；噻唑蓝（MTT）、胎牛血清（FBS）、二甲基亚砜（DMSO）、DMEM培养基，北京西美杰科技有限公司提供；人胃癌细胞株（SGC7901）、人肝癌细胞株（Bel-7402）、人结肠细胞株（SW620），中国医学科学研究院肿瘤细胞库提供。

UV1901型紫外-可见分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司产品；HBS-1096A型酶联免疫检测仪，南京德铁实验设备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 三萜类化合物提取工艺条件的确定

取干燥的中华猕猴桃根粉碎，过40目筛，置于提取器中，以不同的硫酸铵质量浓度（A）、异丙醇体积分数（B）、不同的超声时间（C） 和料液比（D）为参数，考查其对三萜类化合物提取率的影响。以香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法测定三萜类化合物的含量[6]。按下述公式计算三萜类化合物的提取率。

式中：C——三萜类物质的质量浓度，mg/mL；

V——提取液的定容体积，mL；

M——样品质量，mg。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.2.2 MTT法评价各种衍生物的抗肿瘤活性

采用MTT法测试所合成的衍生物对人胃癌细胞株（SGC-7901）、人肝癌细胞株（Bel-7402） 和人结肠癌细胞株SW620的体外生长增殖抑制活性。

试验步骤如下：①收集对数期生长状态良好的癌细胞，加入20%的胰蛋白酶消化液，制成细胞悬液，并将细胞密度控制在5×104个/mL。②取细胞悬液接种于96孔板上，200 μL/孔，采用DMEM培养基（加入10%胎小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），置于CO2恒温培养箱中于37℃条件下培养24 h。③换液，按预设的质量浓度梯度（最大为100 mg/mL） 加入待测样品,每孔50 μL，每个质量浓度梯度下设计5个平行孔，同时以等量的DMSO进行空白对照试验；置于CO2恒温培养箱中于37℃条件下培养48 h。④离心后弃去培养液，小心用PBS缓冲液冲洗3遍后，再加入含MTT（5 mg/mL）的培养液，然后在CO2培养箱中继续温育4 h。⑤吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪于波长493 nm处测量各孔的吸光度（OD值）。得到的结果采用下列代入式计算各物质对肿瘤细胞生长的抑制率。

以抑制率为纵坐标、以衍生物的质量浓度为横坐标作图，求出每个衍生物的IC50值。

2 结果与分析

2.1 正交试验

正交试验结果分析见表2。

表2 正交试验结果分析

由表2可知，影响中华猕猴桃根中三萜类物质提取率因素的主次顺序为超声时间＞料液比＞硫酸铵质量浓度＞异丙醇体积分数。正交试验的最佳组合为A3B1C1D2，即硫酸铵质量浓度0.18 g/mL，异丙醇体积分数40%，超声时间30 min，料液比1∶9。

2.2 验证试验

因确定的提取三萜类物质最佳工艺条件不在正交试验的9个组合中，为了考查最优条件的重现性进行验证试验。采用最佳提取工艺条件A3B1C1D2，重复5次试验过程，计算得出中华猕猴桃根三萜类物质的提取率为6.78%±0.03%。试验结果表明，在上述条件下三萜类物质的提取率相对稳定，能达到优化的目的。

2.3 衍生物的抗肿瘤评价与分析

采用MTT法测定三萜类化合物对3种肿瘤细胞的抑制活性，计算抑制率。

三萜类化合物对3种肿瘤细胞的抑制率见表3。

表3 三萜类化合物对3种肿瘤细胞的抑制率

由表3可知，中华猕猴桃根中的三萜类化合物对胃癌细胞株、肝癌细胞株、结肠癌细胞株均有一定的抑制活性。其中，对胃癌细胞株抑制活性最为突出，抑制率为38.1%，当三萜类化合物质量浓度为80 mg/mL时，抑制率既已超过50%，且抑制率随物质质量浓度增加而增加。

3 结论

三萜类化合物是中华猕猴桃根中主要活性物质。试验中采用硫酸铵和异丙醇组成的双水相系统，并结合超声波提取确定最佳提取工艺条件为硫酸铵质量浓度0.18 g/mL，异丙醇体积分数40%，超声时间30 min，料液比1∶9。双水相提取与超声波提取相结合提取三萜类物质的工艺过程与传统的提取技术相比，工艺条件更为温和，三萜类物质更易于分离。将提取得到的三萜类化合物采用MTT法分析其抗肿瘤活性。结果表明，中华猕猴桃根中的三萜类物质对所选的3种肿瘤细胞均有一定的抑制活性，尤其是对胃癌细胞的抑制活性最为显著。