果蔬中不可萃取多酚的研究进展

邓雅妮，郭时印，肖 航，唐忠海

果蔬中富含活跃而具有保健作用的植物化学物质，多酚是其中主要的具有功能活性的一种次生代谢产物，分子结构中有若干酚性羟基，在大多数植物性食物中的几乎所有器官中都很常见[1]。根据多酚的结合方式和萃取方法的不同，分为可萃取多酚（Extractable polyphenol，简称EP） 和不可萃取多酚（Non-extractable polyphenol，简称 NEP）[2-4]。NEP 的测定不能用单纯的溶剂提取，需要通过化学或酶处理萃取物的残渣以打破多酚物质与细胞壁结合的化学键，才能将其分离出来[2-3]。大多数文献中的多酚仅局限于EP，然而据已有研究表明，不可萃取多酚的含量在多种植物资源中远高于可萃取多酚，且不可萃取多酚在人体肠道中能产生可被吸收的代谢产物，表现出较可萃取多酚更强的抗氧化作用，以及在胃肠道方面的生理作用。综述了果蔬中不可萃取多酚（NEP）的研究进展，重点是不可萃取多酚的提取、测定、生物可利用性及与健康相关的特性，以期为果蔬中不可萃取多酚在食品中进一步的研究和生物活性方面的应用提供参考和思路。

可萃取多酚和不可萃取多酚见图1[5]。

1 果蔬中的不可萃取多酚

图1 可萃取多酚和不可萃取多酚

EP是指通过简单的水或有机溶剂萃取就可获得的由低分子量化合物组成的混合物，包括可萃取原花青素（EPA）、一部分水合单宁酸（HT），以及其他黄酮类、酚酸等。NEP也被称为高分子抗氧化剂，主要是指结合于细胞壁上的一些不可萃取原花青素（Non-extrable proanthocyanidins，简称 NEPA） 和可水解多酚（Hydrolysable polyphenols，简称HP），约占总多酚的57%[3]。在上个世纪70年代，不可萃取原花青素在豆科植物中被发现，但由于当时缺乏先进的分析和检测手段而未受到重视，直至上世纪90年代国外科学家才开始对植物性食物中的不可萃取多酚进行深入研究，2007年Fulgencio Saura Calixto带领的团队研究了传统西班牙饮食中果蔬、豆类、谷类等食物中的NEP[4]。2009年Sara Arranz提出植物性食物中NEP的含量被远远低估了[2]。近年来，国内学者如程安玮[6]、韩彩静[7]、阎海青[8]等人开始关注并研究果蔬中的NEP，研究较多的是蓝莓果实及叶、洋葱、火棘等膳食多酚含量丰富的果蔬。

2 不可萃取多酚的提取

对不可萃取多酚的提取，其中原料的处理包括新鲜、冻干或烘干呈粉末状的[9]。用有机溶剂萃取时一般选择甲醇、乙醇，除此之外丙酮、乙酸乙酯等也常被应用。

2.1 酸水解法

2007年西班牙学者Fulgencio Saura Calixto等人提出用酸法提取不可萃取多酚，先使用甲醇和丙酮萃取样品中的可萃取多酚，留滤渣备用。然后，使用5 ml/L的HCl-丁醇溶液，于100℃条件下提取3 h，萃取出残渣中的不可萃取原花青素（NEPA）。利用分光光度计，于波长550 nm处测定吸光度，根据在相同条件下处理得到的角豆荚的单宁含量绘制的标准曲线，计算出NEPA的含量。同时用甲醇-硫酸（90∶10）溶液，于85℃条件下提取20 h处理得到可水解多酚（HPP），可水解多酚主要是由可水解单宁、酚酸、羟基肉桂酸组成，在强酸的作用下便从残渣中萃取出来。将过滤后的水解产物注射到反向色谱中的C18柱中，通过色谱法进行测定。结果显示，果蔬中不可萃取多酚（包括NEPA和HTT） 的含量远高于可萃取多酚，水果中不可萃取多酚和可萃取多酚含量分别约为 19.3±3.58 mg/（g·DW），5.38±0.20 mg/（g·DW），蔬菜中不可萃取多酚和可萃取多酚含量分别约为 4.56±0.33 mg/（g·DW），0.86±0.13 mg/（g·DW），其中不可萃取原花青素没有在蔬菜中检测出来[4]。2009年西班牙学者Sara Arranz也用类似方法提取不可萃取多酚，结果显示不可萃取多酚的含量是可萃取多酚的5倍多[2]。程安玮等人[6]用酸性提取方法对蓝莓中NEP进行了研究，测定到蓝莓中NEPP的含量远远高于EP的含量，甚至超过7倍，最高的含量达到23.63±1.22 mg/（g·DW）。

2.2 碱水解法

除了应用较多的酸水解法处理外，不可萃取多酚还能用碱法提取，2013年阎海清等人[8]采用碱法提取蓝莓中的不可萃取多酚，样品经过乙醇处理，再经超声、离心等操作后，收集沉淀，烘干、粉碎，将NaOH溶液加入离心管进行超声处理，然后离心、过滤，收集萃取液，即得到不可萃取多酚溶液。程安玮等人[6]通过比较发现，碱水解法处理得到的NEP的含量远比酸水解法多，最大值可达到54.96 mg/（g·DW）[10]。

2.3 其他方法

随着分析检测技术的进步，人们开始使用更先进的方法，如酶法提取、超声或微波辅助萃取、减压萃取法提取植物性食物中的多酚。若要想得到纯度较高的不可萃取多酚溶液，就需要对粗萃取液进行分离纯化。国内学者程安玮等人[6]2010年采用超声辅助酸水解的方法萃取蓝莓中不可萃取多酚，2014年阎海青等人[8]采用超声辅助NaOH碱水解的方法对不可萃取蓝莓多酚的萃取工艺进行研究，并利用大孔树脂动态吸附、乙酸乙酯层析获得纯度较高的不可萃取多酚溶液，再利用高效液相色谱法分析其组分，发现不可萃取多酚的组成主要是燕草色素类、飞燕草色素类、牵牛花色素类、矢车菊色素类、芍药花色素、锦葵色素类和乙酰化的花色苷，与可萃取多酚大致相似[11]。韩彩静等人[7]研究采用大孔树脂HPD-IOOC进NEP的动态纯化，得到相同的结论。

3 不可萃取多酚的代谢和生物可利用性

果蔬中的不可萃取多酚被人体摄入后，不能在口腔、胃、小肠中从食品基质中被释放，而是保持完整地到达结肠，被结肠内微生物群发酵，糖苷键断裂形成苷元或进一步发生环裂解，产生具有生物活性的代谢产物，从而被人体吸收利用或排泄[12]，这些代谢产物能在人体的尿液或粪便中检测出来[13]。NEP在结肠中的释放机制主要有2种，一是与糖、有机酸、脂类等酯化的酚类在结肠菌群产生的酯酶作用下断裂酯键。二是鞣花单宁等聚合物则需微生物裂解其共轭基团[14]。一些学者指出不可萃取原花青素在结肠内被分解成苯乙酸、苯丙酸、苯丁酸或其羟基化合物，酚酸经肠道直接吸收或与肠道细胞表面特定或非特定受体结合，通过影响多个基因的表达和信号转导发挥生理功能[15-16]。水解单宁等聚合物则在肠道微生物（如大肠杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、杆菌、真杆菌等）的作用下了进行生物转化[17]。也有学者提出鞣花单宁在微生物群的作用下水解成鞣花酸、尿石素等，能在血液中检测出来[18]。Kubow S等人[19]研究发现，紫肉甘薯中花色素苷降解和生物有效性依赖于结肠微生物的分解。Padayachee A等人[20]研究发现果蔬中与胞壁结合的多酚在结肠中通过细胞壁降解菌作用而被释放。PãⒸRez-JimãⒸNez J等人[13]指出NEP的代谢产物在人体内的循环时间比EP长，使得NEP部分的食品基质能够在结肠内发酵得更久。

关于不可萃取多酚的生物活性在上个世纪就通过体外试管试验和动物试验证实了[21]，试验显示NEP不受肠道内消化液的干扰，必须经过肠道酶或微生物菌群水解，释放酚苷元才能被吸收，结肠内的微生物发挥了非常重要的作用。在吸收过程中，膳食多酚先后在肠和肝脏中代谢，主要包括甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化。吸收后一部分多酚进入血液循环，一部分被外排回肠腔。酚类化合物的母核结构以及羟基的数目和位置影响它们与代谢酶、药物转运载体的亲和力，在胃肠道体现不同的吸收特性，最终影响膳食多酚的生理效应和功能活性。其他成分的存在，如多糖和蛋白质，可能会影响NEP的发酵效率，有研究显示，膳食纤维的存在可以促进不可萃取多酚的结肠发酵[22]。

4 不可萃取多酚的生物活性

早在2000年，就有学者结合体外试管试验[23-24]、细胞培养[25]、动物试验[26]、人体试验[27]来研究NEP与健康相关的特性。许多研究显示，NEP在肠胃道健康方面发挥了重要作用，主要通过以下几个机制的综合作用：一是NEP能增强促进结肠内容物抗氧化能力和内源性抗氧化剂的表达，从而抵抗存在于结肠内的促肿瘤活性氧簇 （ROS）[12，13，28-29]。许盈芄等人[30]对火棘中不可萃取多酚的研究表示，ABTS及FRAP抗氧化能力均与NEPP含量呈良好正相关。二是促进肠道益生菌的增殖，减少有害菌的比例[31]。三是上皮组织诱导的细胞凋亡以及隐窝数量和尺寸的减小，促进了抗增殖能力[29]。四是对肠道癌症的抑制作用[32]。五是对基因表达的调节作用[33]。除此之外，在结肠内产生的这些代谢产物还能预防脑血管疾病（CVD） 的发生，降低血压、血糖和血浆胆固醇[33-34]，NEP对慢性疾病的影响成为当今的研究热点。

5 结语

不可萃取多酚主要由不可萃取原花青素和可水解多酚组成，虽然果蔬中不可萃取多酚的研究远少于可萃取多酚，但已有研究显示不可萃取多酚的含量远高于可萃取多酚。不可萃取多酚在结肠中的代谢和生物可利用度，与肠道健康方面有紧密联系，对慢性疾病能起到预防和治疗的作用，也因此果蔬中不可萃取多酚潜藏的价值成已为讨论的热点。但是其在人体内生物转化途径的相关数据尚不够明确，生物可利用度也不高，有待进一步的研究。