肉鸡产业链主要抗药性菌株的分离鉴定与抗药性分析

贾纪美 朱见深 骆延波 李璐璐 胡明 赵敏 杨胜福 刘晓文 戴美学 齐静 刘玉庆

摘要：為分析肉鸡产业链各环节主要抗药性菌株的流行状况，保证食源性公共卫生安全，本试验采集肉鸡养殖、屠宰及加工各环节的样本108份，通过6种不同含药物培养基初步筛选抗药性菌株，经VITEK2自动微生物鉴定和自动药敏检测，并与微量肉汤稀释法药敏试验进行比较。结果表明，从肉鸡产业链各环节共鉴定获得664株细菌，其中前三位的优势细菌为大肠杆菌375株（56.5%）、肺炎克雷伯菌110株（16.6%）和奇异变形杆菌79株（11.9%）。微量肉汤稀释法药敏试验结果显示，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌对阿莫西林/克拉维酸、多西环素抗药率都在90%以上，对环丙沙星和丁胺卡那霉素抗药率在34.6%～87.0%之间，对美罗培南敏感。三种抗药菌显示多重抗药性特征，集中在三、四重抗药水平。VITEK2自动药敏试验结果显示，大肠杆菌对氨苄西林、头孢唑啉抗药率分别是98.3%、92.6%；全部对厄他培南、亚胺培南敏感。肺炎克雷伯菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦抗药率分别是97.3%、89.1%；大部分对厄他培南和亚胺培南敏感，肺炎克雷伯菌的抗药性水平普遍稍高于大肠杆菌，二者呈正相关性。微量肉汤稀释法和VITEK2自动药敏试验两种方法重叠使用了环丙沙星和丁胺卡那霉素，检测结果差异不显著。肉鸡产业链各环节大肠杆菌的抗药性显著高于EUCAST数据库的结果，建议相关部门应加强细菌抗药性监测，并逐步降低抗药性，保障食品安全和公共卫生。

关键词：肉鸡；抗药性；大肠杆菌；肺炎克雷伯菌；鉴定；药敏试验

中图分类号：S852.6文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）07-0013-07

Abstract In order to explore the prevalence of main antibiotic-resistant strains in the industrial chain of broiler chickens and ensure food-borne public health safety， we collected 108 samples of broiler chickens from different spots of breeding， slaughtering and processing， and screened antibiotic-resistant strains through 6 different antimicrobial-containing culture media. The VITEK2 was used for automatically microbiological identification and automatic antimicrobial susceptibility testing（AST）， and the result was compared with that by broth microdilution method. The results showed that a total of 664 strains of bacteria were identified from different aspects of the broiler industrial chain. Among them， 375 strains （56.5%） of Escherichia coli， 110 strains （16.6%） of Klebsiella pneumoniae and 79 strains （11.9%） of Proteus mirabilis were the top three dominant bacteria. The result of broth microdilution method showed that the resistance rates to amoxicillin/clavulanic acid and doxycycline of E. coli，K. pneumoniae and P. mirabilis were all more than 90%， while 34.6%～87.0% of resistance rates to ciprofloxacin and amikacin. All isolated strains were sensitive to meropenem. Furthermore， these antibiotic-resistant bacteria exhibited multidrug resistance and tended to triple and quadruple resistance levels. AST of VITEK2 CDCAST card showed that the resistance rates to ampicillin and cefazolin of E. coli were 98.3% and 92.6% respectively， and all isolated E. coli strains were sensitive to ertapenem and imipenem. The resistance rates to ampicillin， ampicillin/sulbactam of K. pneumoniae were 97.3% and 89.1% respectively， and the majority strains was sensitive to ertapenem and imipenem. Whats more， the resistance rate of K. pneumoniae was generally higher than that of E. coli， and there was a positive correlation on resistance rate between them. Antibiotic ciprofloxacin and amikacin were both used in the methods of broth microdilution method and VITEK2 automatic antibiotic susceptibility testing， and there was no significant difference between the two methods. The antibiotic resistance level of E. coli in broiler industrial chain was significantly higher than that of EUCAST. It is suggested that relevant departments should strengthen the surveillance of bacterial antibiotic resistance， and gradually reduce the high antibiotic resistance， so as to ensure food safety and public health.

Keywords Broiler chicken； Antimicrobial resistance； Escherichia coli； Klebsiella pneumoniae； Identification； Antimicrobial sensitivity testing

近年来，随着肉鸡养殖集约化程度的日益提高和抗菌药物的广泛应用，造成动物源抗药菌株不断增多，抗药机制日趋复杂[1]，给动物疾病防治带来严峻挑战。动物源抗药菌和抗药基因可以通过不同环节传递给人类，危害人类及公共健康[2]。无论在发达国家还是发展中国家，由病原微生物引起的食源性疾病已成为食品安全中的重大问题[3]。

细菌病是肉鸡养殖过程中常见的疾病之一。细菌抗药性问题导致一些条件致病性病原微生物引起的疾病得以传播和流行。最常见的鸡大腸杆菌病频发，且越来越难以用药物治愈。另外，以前并不常见的细菌如肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等引起的疾病现在也频繁发生[4]，使得家禽临床发病情况越来越复杂，给临床防治细菌病造成很大困难。

大肠杆菌（Escherichia coli）[5]、 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）[6-8]和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）[9，10]都是重要的条件致病菌，且能造成多种动物发病，也能感染人类，是人畜共患传染病病原，应引起足够的重视。本试验采集肉鸡养殖、屠宰和加工等环节的样本，利用不同的药物培养基初步筛选出样品中的优势抗药菌株，经鉴定获得大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌三种主要抗药菌，并对这些菌株进行细致的药敏试验，分析其抗药性水平，以期为降低肉鸡产业链细菌抗药性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 标准菌株

大肠杆菌标准菌株E.coli ATCC25922，由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存。

1.2 药品和药敏鉴定卡

注射用盐酸万古霉素、阿莫西林/克拉维酸钾购自山东鲁抗医药股份有限公司；注射用头孢哌酮/舒巴坦购自辉瑞制药有限公司；注射用头孢噻肟钠购自齐鲁制药有限公司；亚胺培南、美罗培南购自中国药品生物制品检定所。多西环素、乳酸环丙沙星、丁胺卡那霉素兽药原粉购自临沂福本正药业有限公司。药敏鉴定卡CDCAST购自梅里埃诊断产品（上海）有限公司。

1.3 主要培养基及试剂

MH培养基（MHA）、MH肉汤（MHB）、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、脑心浸液培养基均购自北京陆桥技术责任有限公司；TSA购自英国OXOID公司。

1.4 试验方法

1.4.1 样品采集 选取山东某大型肉鸡养殖、加工及屠宰场，于2013年6月，用无菌棉拭子采集商品肉鸡场健康鸡肛拭子50份、病死鸡肛拭子9份、病死鸡肝脏拭子9份、饲养员鼻拭子2份；采集健康蛋鸡肛拭子10份、饲养员鼻拭子8份；采集屠宰场待宰鸡鼻拭子9份，分割鸡肉的体表、鸡心、鸡肝、鸡翅、鸡腿、鸡胸、洗涤水共11份。共计采集样品108份。将拭子样品放入含少量无菌生理盐水的EP管中，带回实验室。

1.4.2 抗性药板配制 分别配制亚胺培南（16 mg/mL）、头孢哌酮/舒巴坦（64/16 mg/mL）、阿莫西林/克拉维酸钾（8/4 mg/mL）的麦康凯培养基，环丙沙星（4 mg/mL）、丁胺卡那霉素（64 mg/mL）、多西环素（16 mg/mL）的脑心浸液培养基，用于抗药菌的初步筛选。

1.4.3 抗药菌株的筛选与分离培养 分别取100 μL各样品生理盐水涂布于上述配制的6种药物培养基上，至37℃培养箱中培养18～24 h。从每个药物平板上挑取形态相似数量较多的其中一个单菌落，再经过伊红美蓝培养基筛选优势菌株，最后划线于MHA培养基上，37℃培养箱中培养18～24 h。用棉签刮取MHA培养基上菌苔，保种到30%的甘油肉汤中，编号，-20℃保藏。

1.4.4 抗药菌株的生化鉴定 取上试甘油菌液无菌划线于TSA培养基，置于37℃培养箱中培养18～24 h。将3 mL无菌生理盐水加入清洁塑料管中，用无菌棉签接种3～5个单菌落至盐水管中，混匀制成菌悬液，用已校正的VITEK 2比浊仪调至0.5～0.7麦氏单位的菌悬液。配置好的菌悬液在接种试卡前，放置时间不能超过30 min。将菌悬液管及GN卡置于载卡台上。使用VITEK 2 System，将载卡台置于仪器中自动鉴定。

1.4.5 鉴定菌株的微量肉汤稀释法药敏试验 利用微量肉汤稀释法对主要分离菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌）进行阿莫西林/克拉维酸钾、乳酸环丙沙星、丁胺卡那霉素、美罗培南、多西环素、头孢哌酮/舒巴坦6种药物的敏感性试验，大肠杆菌标准菌株E.coli ATCC25922作为质控菌株，根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）标准判定药敏结果[11]。

1.4.6 鉴定菌株的CDCAST卡药敏试验 选择含有18种抗生素的CDCAST卡，使用VITEK2上机对主要分离菌（大肠杆菌和肺炎克雷伯菌）进行自动测定药敏试验。药物包括氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松钠、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、丁胺卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、乳酸环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑。大肠杆菌标准菌株E.coli ATCC25922作为质控菌株，根据CLSI标准判定药敏结果[11]。

2 结果与分析

2.1 肉鸡产业链各环节主要抗药菌的分离与鉴定

本试验共采集样品108份，经不同药物平板初步筛选抗性菌株，通过VITEK 2 System生化鉴定共获得664株细菌，包括抗亚胺培南菌株119株，抗头孢哌酮/舒巴坦菌株16株，抗阿莫西林/克拉维酸钾菌株144株，抗环丙沙星菌株127株，抗丁胺卡那霉素菌株128株，抗多西环素菌株130株；经不同药板筛选，其主要抗性菌株为大肠杆菌375株（56.5%），肺炎克雷伯菌110株（16.6%）和奇异变形杆菌79株（11.9%），其他菌株的分离鉴定数量相对较少（表1）。

2.2 微量肉汤稀释法和VITEK2自动药敏试验结果

微量肉汤稀释法药敏试验结果显示，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌对阿莫西林/克拉维酸、多西环素抗药性较高，抗药率都在90%以上；对乳酸环丙沙星和丁胺卡那霉素抗药性次之，抗药率在34.6%～87.0%之间；而所有菌株都对美罗培南十分敏感（图1A）。对于选定的抗生素，用于药敏试验的370株大肠杆菌五重抗药有8株（2.2%）；四重抗药92株（24.9%），三重抗药149株（40.3%），二重抗药103株（27.8%）。108株肺炎克雷伯菌中五重抗药23株（21.3%）；四重抗药49株（45.4%），三重抗药22株（20.4%），二重抗药5株（4.6%）。79株奇异变形杆菌中五重抗药2株（2.5%）；四重抗药29株（36.7%），三重抗药38株（48.1%），二重抗药8株（10.1%）（图1B）。大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌基本在三、四重抗药水平。而VITEK2的CDCAST卡药敏试验结果显示，大肠杆菌对氨苄西林、头孢唑林抗药性最高，抗药率分别是98.3%、92.6%；全部对厄他培南、亚胺培南敏感。肺炎克雷伯菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦抗药性最高，抗药率分别是97.3%、89.1%；大部分对厄他培南和亚胺培南敏感，敏感率均为93.6%，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢替坦敏感性也较高。本试验中肺炎克雷伯菌的抗药性水平普遍高于大肠杆菌（图1C）。

微量肉汤稀释法和VITEK2自动药敏试验两种方法中重叠使用了乳酸环丙沙星和丁胺卡那霉素。微量肉汤稀释法药敏试验中，大肠杆菌对乳酸环丙沙星和丁胺卡那霉素的抗药率分别是63.5%、34.6%，肺炎克雷伯菌的抗药率分别是87.0%、69.4%；VITEK2自动药敏试验中，大肠杆菌对两者的抗药率分别是65.6%、29.2%，肺炎克雷伯菌对两者的抗药率分别是81.8%、66.4%。两种方法的药敏试验结果差异不显著（P>0.05）。

2.3 大肠杆菌與肺炎克雷伯菌抗药性水平相关性

通过对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对选定抗生素的抗药率统计，并经Spearman 相关性分析发现，大肠杆菌与肺炎克雷伯菌的抗药性水平存在极显著正相关关系（P<0.001），即对于同种抗生素，大肠杆菌抗药率高则肺炎克雷伯菌的抗药率也高，反之也是如此（图2）。

2.4 肉鸡产业链环节主要抗药菌对4种主要抗生素的MIC频率分布

单纯分析抗药率虽能在一定程度上反映菌株的抗药性水平，但是具体的MIC分布更能说明菌株的抗药性程度。通过MIC统计分析发现，抗药率较高的抗生素其MIC集中分布于数值较高处，另外大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌对阿莫西林/克拉维酸钾抗药率不仅高而且MIC的数值也集中于较高处（图3）。

2.5 与EUCAST数据库中大肠杆菌抗药性水平比较

通过与EUCAST数据库中大肠杆菌的MIC分布进行比较发现，本试验中的大肠杆菌MIC多分布在数值较高处，而EUCAST相对处于数值较低处（图4），仅有大肠杆菌对丁胺卡那霉素的抗药性水平与EUCAST相当。

3 讨论与结论

本试验从肉鸡养殖、屠宰和加工等环节采集108份样本，经过不同的药物培养基初筛及进一步的生化鉴定，共获得664株抗性菌株，包含22个种，其中以大肠杆菌（56.5%）、肺炎克雷伯菌（16.6%）和奇异变形杆菌（11.9%）为最优势菌株，这三种菌都是条件致病菌，由于此次试验未做致病性研究，不能确定分离菌株与其致病性的关系。其他菌株的分离鉴定率较低，这可能与我们设定的药物、培养基、培养条件及人为筛选可培养的优势菌株有一定关系。

微量肉汤稀释法与VITEK2自动药敏试验法的检测结果差异不显著。根据两者检测数据综合分析，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌对四环素类、青霉素类抗生素（除哌拉西林/他唑巴坦外）、氨基糖苷类抗生素抗药率较高，对碳青霉烯类抗生素敏感，而对头孢菌素类抗生素存在不同程度的抗药。据陈静[12]、江飙[13]、赖婧[14]、李娜[15]、Pantozzi[16]等报道，不同时间、地点试验菌株对兽医临床常用药抗药性不同，但都表现出多重抗药，且抗药性较高。

全球每年消耗的抗生素大多数被用于食源性动物养殖业，且滥用现象严重，报道屡见不鲜，抗药性菌株不可避免地产生。抗药基因又可随细菌繁殖垂直传代，也可通过携带可转移遗传因子包括质粒、转座子和噬菌体等使抗药性扩散传播。动物体内尤其肠道是非常丰富和复杂的菌种库和基因库，抗药基因可能会随时转移。动物源抗药菌可以通过多种途径传递给人类，如动物性食品—消费链、与动物直接接触、水源污染、空气传播和受到动物排泄物污染的农产品等[17]，威胁人类的健康，使人类承担更大的食品安全和生命健康风险[18]。本试验分离鉴定的三种条件性致病菌对多种抗生素都表现出非常高的抗药率及多重抗药性特征，但对动物临床上很少使用的碳青霉烯类抗生素相对比较敏感。建议相关部门加强肉鸡产业链各环节主要流行菌株的抗药性检测，从源头上切断产业链抗药菌和抗性基因向人类的传播，规范、合理、科学、有序地选择药物预防和治疗，及早采取措施干预，是遏制细菌抗药性的重要举措[19]。

参 考 文 献：

[1] Yao X， Doi Y， Zeng L， et al. Carbapenem-resistant and colistin-resistant Escherichia coli co-producing NDM-9 and MCR-1[J]. Lancet Infect. Dis.， 2016， 16（3）： 288-289.

[2] Ferber D. Antibiotic resistance. Livestock feed ban preserves drugs power[J]. Science， 2002， 295（5552）： 27-28.

[3] Law J W， Ab Mutalib N S， Chan K G， et al. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens： principles， applications， advantages and limitations[J]. Front. Microbiol.， 2014， 5： 770.

[4] 潘玉善. 禽源大肠杆菌、奇异变形杆菌多重耐药的分子特征及CTX-M基因传播扩散机制[D].郑州：河南农业大学， 2012.

[5] Overdevest I， Willemsen I， Rijnsburger M， et al. Extended-spectrum β-lactamase genes of Escherichia coli in chicken meat and humans， the Netherlands[J]. Emerg. Infect. Dis.， 2011， 17（7）： 1216-1222.

[6] Nordmann P， Cuzon G， Naas T. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria[J]. Lancet Infect. Dis.， 2009， 9（4）： 228-236.

[7] Munoz-Price L S， Poirel L， Bonomo R A， et al. Clinical epidemiology of the global expansion of Klebsiella pneumoniae carbapenemases[J]. Lancet Infect. Dis.， 2013， 13（9）： 785-796.

[8] Liu P， Li X， Luo M， et al. Risk factors for carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection： a meta-analysis[J]. Microb. Drug Resist.， 2018， 24（2）： 190-198.

[9] Wang M， Guo Q， Xu X， et al. New plasmid-mediated quinolone resistance gene， qnrC， found in a clinical isolate of Proteus mirabilis[J]. Antimicrob. Agents Chemother.， 2009， 53（5）： 1892-1897.

[10]Korytny A， Riesenberg K， Saidel-Odes L， et al. Bloodstream infections caused by multi-drug resistant Proteus mirabilis： epidemiology， risk factors and impact of multi-drug resistance[J]. Infect. Dis.， 2016， 48（6）： 428-431.

[11]Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI）.M100-S26 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twenty-sixth informational supplement[M].Wayne：CLSI，2016.

[12]陳静，王贵升，田夫林，等. 山东省鸡大肠杆菌和沙门氏菌的发病趋势和耐药性变化分析[J]. 畜牧兽医科技信息， 2007（6）： 28-31.

[13]江飙，董嘉文，张献杰，等. 广东地区动物源性大肠杆菌的分离及药敏分析[J]. 中国兽药杂志， 2009，43（1）： 14-16.

[14]赖婧，刘洋，汪宇，等. 800株不同动物源大肠杆菌的耐药性监测[J]. 中国兽医杂志， 2011， 47（4）： 12-14.

[15]李娜，张保平，王文彬，等. 湖南省常德地区鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 江苏农业科学， 2014， 42（7）： 226-228.

[16]Pantozzi F L， Ibar M P， Nievas V F， et al. Wild-type minimal inhibitory concentration distributions in bacteria of animal origin in Argentina[J]. Rev. Argent Microbiol.， 2014， 46（1）： 34-40.

[17]Wang Y， Zhang R， Li J， et al. Comprehensive resistome analysis reveals the prevalence of NDM and MCR-1 in Chinese poultry production[J]. Nat. Microbiol.， 2017， 2： 16260.

[18]郑璇，郑育洪. 国内外超级细菌的研究进展及防控措施[J]. 中国畜牧兽医文摘，2012，28（1）： 69-75.

[19]刘雅妮，商军，金凌艳，等. 鸡源大肠杆菌耐药性监测[J]. 上海畜牧兽医通讯， 2010（4）： 30-31.