SPF鸡粪菌移植对雏鸡肠道菌群和大肠杆菌抗药性的影响

朱见深 王进文 张庆 骆延波 李璐璐 胡明 宋新慧 戴美学 齐静 刘玉庆

摘要：獸用抗生素的广泛使用引起肠道细菌严重的抗药性和菌群生态紊乱，并可能导致抗药性人畜共患病原菌的传播，给公共卫生带来严峻挑战，因此通过粪菌移植从动物源头降低肠道菌群的抗药性势在必行。本试验首先通过16S rDNA高通量测序技术比较粪菌移植供体SPF蛋鸡及普通商品肉鸡的粪便菌群，然后经泄殖腔滴注方式接种1日龄SPF雏鸡，于7日龄和35日龄测定移植后受体粪便菌群的微生物组，用琼脂稀释法测定移植前后肠道指示菌株大肠杆菌的抗药性水平。结果表明，商品肉鸡粪便菌群拥有更高的多样性，而SPF蛋鸡粪便菌群组成更为均一。除了共同拥有较多的厚壁菌门细菌，商品肉鸡还含有较多的拟杆菌门细菌而SPF蛋鸡则含有较多的变形菌门细菌。在属水平上，商品肉鸡的优势菌属是粪栖杆菌属、拟杆菌属和别样杆菌属，而SPF蛋鸡的优势菌属为肠球菌属、埃希-志贺菌属以及克雷伯氏杆菌属。药敏试验结果表明，SPF蛋鸡拥有对抗生素极为敏感的菌群，商品肉鸡拥有较高的抗生素抗药性菌群。将两组粪便菌群移植给新生雏鸡后，抗药性水平得到传递。该结果说明通过SPF鸡粪菌移植雏鸡，能安全地从源头降低肠道菌群抗药性，抵抗家禽养殖环境中高抗药性病原菌的侵害，为遏制动物源细菌抗药性提供一种新的解决方法。

关键词：抗药性；SPF鸡；粪菌移植；16S rDNA高通量测序；肠道菌群

中图分类号：S852.6文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）07-0006-07

Abstract The widespread use of veterinary antibiotics causes serious bacterial resistance and gut bacterial ecological disturbance， as well as the spread of antibiotic-resistant zoonotic pathogens， which posing a serious challenge to public health. Therefore， it is imperatived to reduce the gut bacterial resistance from the source of animals through fecal micorbiota transplantation （FMT）. Firstly， the 16S rDNA high-throughput sequencing technology was used to analyze the fecal microbiota of SPF laying hens and ordinary commercial broilers to select appropriate donor. Then one-day-old SPF chicks were inoculated by cloaca inoculation， and analysis of fecal microbiota was conducted at the 7-and 35-day-age respectively after transplantation. Furthermore， the agar dilution method was used to determine the level of antibiotic resistance of the intestinal indicator strain E. coli before and post transplantation. The results showed that the fecal microbiota of commercial broilers had higher alpha diversity， while that of SPF laying hens was more uniform. In addition to sharing the same Firmicutes in common， commercial broilers had more Bacteroidetes and SPF laying hens had more Proteobacteria. At the genus level， the dominant genus of commercial broilers were Faecalibacterium， Bacteroides and Alistipes， while SPF laying hens were Enterococcus， Eich-Shigella and Klebsiella. The results of antimicrobial susceptibility testing showed that E. coli strains of SPF laying hens were very sensitive to testing antibiotics， while commercial broilers had a higher antibiotic-resistant flora. After the two groups of fecal microbiota were transplanted into newborn chicks， the level of antibiotic resistance was transferred. These results suggested that FMT from SPF chickens to chicks could safely reduce the intestinal bacterial resistance from source and resist the invading of the high-resistant pathogenic bacteria in the poultry breeding environments， which providing a new solution to repress the bacterial resistance of animals.

Keywords Antimicrobial resistance； SPF chicken； Fecal microbiota transplantation；16S rDNA high-throughput sequencing； Intestinal flora

抗生素是一把四刃剑[1]，其不合理使用加速了抗药菌和抗药基因的产生及其在环境中的传播，导致很多抗生素失效，使一些感染无法治愈，成为全球公共卫生的一大威胁[2，3]；另外，青霉素类、喹诺酮类、氨基糖苷类及碳青霉烯类抗生素都是广谱抗生素，在使用这些抗生素时难免“波及无辜”，破坏宿主正常的共生微生物群[4]，而共生微生物群与宿主的健康息息相关，菌群紊乱会导致许多疾病[5]。使用抗生素（如链霉素）会促使宿主细胞及菌群代谢改变，而其代谢产物会促进一些病原菌（鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、艰难梭菌）的生长[6，7]。因此，减少抗生素使用势在必行。

为解决抗药性问题及减少抗生素的使用，目前发展出许多应对策略，包括研发新的抗菌药物、应用噬菌体疗法及利用益生菌等[8-10]。随着菌群研究的成熟，通过调节菌群进行病原菌感染治疗及清除抗药菌成为一种新颖、有效的策略[11]。

粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是一种重塑肠道菌群的方法，是治疗肠道菌群紊乱导致疾病的重要手段[12]。目前FMT应用于人类治疗艰难梭菌感染（CDI）取得了巨大成功[13]。但是关于动物养殖中的FMT相对落后，在猪上FMT仅有数篇文献可查，这些文献多研究如何改善猪的肠道健康及提高生长效果[14，15]。在鸡上FMT的研究更少之又少，基于此，本研究尝试利用粪菌移植手段降低商品肉鸡存在的高抗药性问题，以期为降低细菌高抗药性现状提供一种新的解决途径。

1 材料与方法

1.1 粪菌移植供体菌群的制备

分别选择商品肉鸡和SPF蛋鸡作为菌群供体进行粪菌移植研究，其中商品肉鸡来源于山东泰安某肉鸡屠宰场，42日龄（标记为Broiler），SPF蛋鸡来源于山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡场，200日龄（标记为SPF）。无菌采集二者的新鲜盲肠内容物，在生物安全柜内称取10 g盲肠内容物置于无菌烧杯内，加入无菌PBS缓冲液，配制成100 mL悬液，搅拌使悬液均一。将均一悬液转移至2个50 mL无菌离心管，1 800 r/min离心10 min使悬液中的大颗粒沉降。将离心后的悬液用经过灭菌的三层滤布（纱布、80目滤布、150目滤布）分别进行过滤，最后获得均一、棕色的接种液。

1.2 粪菌移植受体雏鸡的选择、分组及接种方式

受体SPF雏鸡来源于山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡场，1日龄，随机分为3组，每组20只，分别为商品肉鸡菌群接种组（标记为R_B），SPF鸡菌群接种组（标记为R_S）及PBS接種对照组（标记为Con）。分别吸取50 μL不同组别的新鲜接种液，对1日龄雏鸡进行泄殖腔滴注。每组分笼饲养至35日龄，自由采食和饮水，温度设置为第1 d 36℃，以后每7 d降低2℃，直至35日龄。

1.3 粪菌移植前后肠道菌群的16S rDNA高通量测序及分析

1.3.1 DNA 提取和PCR扩增 根据E.Z.N.A. Soil试剂盒（Omega Bio-Tek， Norcross， GA， USA）说明书进行供体和受体粪样总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop 2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′） 引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共27个循环；最后72℃延伸10 min（PCR仪：ABI GeneAmp 9700型）。扩增体系为20 μL：5×FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，引物（5 μmol/L）各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板0.2 μL，补ddH2O至20 μL。

1.3.2 Illumina Miseq测序 使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City， CA， USA）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST（Promega， USA） 进行检测定量。根据Illumina MiSeq 平台（Illumina， San Diego， USA）PE300标准操作规程将纯化后的扩增片段构建文库。构建文库步骤：连接“Y”字形接头；使用磁珠筛选去除接头自连片段；利用PCR扩增进行文库模板的富集；氢氧化钠变性， 产生单链DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.3.3 数据处理 原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接：设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50 bp的序列；barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除模糊碱基；根据重叠碱基（overlap）将两端序列进行拼接，overlap需大于10 bp，并去除无法拼接的序列。使用UPARSE软件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier （http：//rdp.cme.msu.edu/） 对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。

1.4 粪菌移植前后肠道优势菌株大肠杆菌的鉴定及药敏试验

粪菌移植前，将供体菌群，即商品肉鸡和SPF鸡的粪便菌群分别划线麦康凯培养基选择性筛选大肠杆菌，然后用质谱法进行鉴定。粪菌移植后，35 d的饲养时间内每隔1 d每组随机收集3个受体SPF雏鸡的新鲜粪样，用同样的方法进行大肠杆菌的分离鉴定。

将质谱鉴定获得的供体和受体菌群中的优势大肠杆菌菌株，利用琼脂稀释法进行药敏试验。选择的药物为氨苄西林、氟苯尼考、新霉素、多西环素、头孢噻呋、阿莫西林-克拉维酸、庆大霉素和多黏菌素8种。根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）的标准进行结果判定，统计抗药率及最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）频率分布[16]。

2 结果与分析

2.1 粪菌移植供体菌群多样性分析

通过OTU聚类分析发现，商品肉鸡（Broiler）粪便菌群含有378个OTU，SPF蛋鸡（SPF）含有127个OTU，两组共同含有92个OTU，而特有的OTU，SPF蛋鸡粪便菌群仅含35个，低于商品肉鸡的286个（图1A）。从α多样性指数（Chao指数）比较可以发现商品肉鸡粪便菌群组成的丰富度及多样性较SPF蛋鸡粪便菌群都高（Welchs t检验，P<0.05），SPF蛋鸡粪便菌群组成更为均一（图1B）。考虑到两组鸡粪便菌群α多样性水平不同，β多样性或许存在差异，我们基于OTUs继续分析，以Weighted UniFrac算法对菌群组成进行进化距离聚类分析，发现SPF的3个重复样本距离近，作为一组，而Broiler的3个重复样本为另一组（图1C）。同样的，在基于OTUs以Bray-Curtis算法计算的主坐标分析（PCoA，principal coordinates analysis）中，两组样本也分散开（图1D）。

2.2 粪菌移植供体菌群结构组成差异比较

通过进化关系及PCoA分析发现两组鸡粪便菌群不同，于是进一步统计两组鸡粪便菌群分类学组成的不同。结果在分类学门（Phylum）水平上，SPF蛋鸡（SPF）主要由厚壁菌门（Firmicutes，59.91%）、变形菌门（Proteobacteria，39.59%）组成；而商品肉鸡（Broiler）的优势菌门也是厚壁菌门（68.31%），而第二优势菌门却为拟杆菌门（Bacteroidetes，25.84%），还含有少量的变形菌门（2.60%），而且两组粪便菌群在变形菌门和拟杆菌门组成结构上存在显著差异，而在厚壁菌门上差异不显著。在属水平上，SPF蛋鸡粪便菌群主要由肠球菌属（Enterococcus，42.56%）、埃希-志贺菌属（Escherichia-Shigella，31.75%）和克雷伯氏杆菌属（Klebsiella，7.02%）组成，而商品肉鸡粪便菌群主要由粪栖杆菌属（Faecalibacterium，13.26%）、别样杆菌属（Alistipes，12.51%）和拟杆菌属（Bacteroides，12.17%）组成，而且这些菌属在两组中的相对丰度都存在显著差异（表1）。

2.3 粪菌移植供体菌群优势菌株大肠杆菌的抗药性水平分析

经过麦康凯培养基选择性分离培养和质谱鉴定，商品肉鸡和SPF蛋鸡分别获得19株和25株大肠杆菌。利用琼脂稀释法对这44株大肠杆菌的抗药率与MIC频率分布进行了统计，结果表明商品肉鸡组对选定的7种抗生素的抗药率均高于SPF蛋鸡组，SPF蛋鸡组对头孢噻呋、阿莫西林-克拉维酸两种抗生素存在低水平抗药菌株，对其他抗生素皆敏感（图2A）；从整体上看，Broiler组中大肠杆菌MIC分布集中于数值较大范围，而SPF组相对集中于数值较小范围（图2B），进一步说明SPF组抗药性水平较低，而Broiler组抗药性水平较高。

2.4 粪菌移植对受体雏鸡肠道菌群微生物组的影响

选择7日龄和35日龄受体雏鸡的粪便进行菌群组成分析，结果表明粪菌移植对受体雏鸡微生物组的影响程度小于受体雏鸡日龄增长带来影响。经单因素方差分析（one-way ANOVA）发现，在分类学门水平上，厚壁菌门和变形菌门在6个小组中存在显著差异（图3B）。而在分类学属水平上，受体雏鸡的优势菌为乳酸杆菌属（Lactobacillus）和埃希-志贺菌属，且乳酸菌属、埃希-志賀菌属以及肠球菌属在6个小组中存在极显著差异（图3A）。

2.5 粪菌移植对雏鸡肠道优势菌株大肠杆菌抗药性的影响

将具有不同抗药性水平的粪便菌群移植给受体雏鸡，并在移植后35日内，对雏鸡每隔1 d采集一次新鲜粪便，分离优势菌株大肠杆菌，并经质谱鉴定，将各组鉴定后的大肠杆菌（肉鸡组46株，SPF组41株，对照组40株），经药敏试验分析得知，接种SPF鸡粪便菌群的雏鸡组（R_S）粪菌中的大肠杆菌对所测试的8种药物的抗药性水平明显低于接种商品肉鸡的受体雏鸡组（R_B），甚至低于对照组（Con）（图4）。同时还发现供体抗药性水平较高时，接种后抗药性水平也较高。该结果说明粪菌移植可将供体粪便大肠杆菌抗药性水平传递给受体雏鸡，达到降低细菌抗药性的目的。

3 讨论与结论

本研究首先通过16S rDNA高通量测序技术分析了在密闭环境中养殖的SPF蛋鸡与在开放环境中养殖的普通商品肉鸡的粪便菌群组成，并比较了二者粪便中大肠杆菌对抗生素的抗药性水平，结果显示两种供体的菌群组成存在很大差异，普通商品肉鸡的肠道菌群多样性优于SPF蛋鸡，而SPF蛋鸡粪便菌群组成更为均一。很多文献介绍散养或放养的鸡肠道菌群多样性相比于笼养的更加丰富，这表明与外界环境的接触对鸡肠道菌群的发展起到一定作用[17，18]。除了共同拥有较多的厚壁菌门细菌，商品肉鸡含有更多的拟杆菌门细菌，而SPF蛋鸡含有更多变形菌门细菌。商品肉鸡的优势菌属是粪栖杆菌属、拟杆菌属，SPF蛋鸡的优势菌属为肠球菌属、埃希-志贺菌属以及克雷伯氏杆菌属，而我们先前的研究结果（数据未展现）发现SPF蛋鸡的优势菌属为乳杆菌属，这可能是个体差异导致的菌群差异。由于SPF鸡无特定病原，饲养环境严格无菌而且不使用抗生素，因此SPF鸡肠道内栖息的菌群对抗生素敏感，而商品肉鸡养殖场环境中的细菌多具有高抗药水平，因此其肠道内定殖的菌多为高抗菌。同时试验结果表明，SPF蛋鸡粪便中大肠杆菌对多种抗生素的抗药性水平明显低于普通商品肉鸡。因此根据抗药性水平筛选确定SPF鸡粪便菌群可以作为粪菌移植的优良供体。

我们将SPF蛋鸡和商品肉鸡的粪便菌群移植给1日龄肠道几乎无菌的SPF雏鸡，饲养至35日龄，观察粪菌移植对受体雏鸡肠道微生物组成及大肠杆菌抗药性的影响，发现粪菌移植使受體雏鸡粪便菌群同组之间更为均一，但总体来看粪菌移植对受体雏鸡粪便菌群的影响程度小于日龄带来的影响。有研究发现饲料添加有机酸对鸡肠道菌群的影响程度小于日龄带来的影响，说明鸡本身的遗传与生理在肠道菌群的动态变化中起到重要作用[19]。也有研究将粪便菌群通过口服、在孵化中的胚上涂抹鸡盲肠内容物等方式移植给受体，结果一定程度上能够表明受体菌群的发展与最初的接种或移植存在关系，但结果的重复性不是很好[20]。

不同的菌群组成会影响宿主的体重和免疫指标[21，22]，在本试验中还发现接受粪菌移植的不同组雏鸡体重、免疫指标无显著差异（数据未展示）。但最重要的是，将两组粪便菌群移植给新生雏鸡后，抗药性水平得到了传递，即受体雏鸡SPF组的抗药性水平（抗药率及MIC分布）相比普通商品肉鸡及对照组显著降低。这为解决家禽养殖环境中的高抗药性现状提供了出路。

FMT多用于治疗人的艰难梭菌感染（CDI）[23]，近来研究发现FMT在治愈CDI的同时，患者肠道内其他抗药菌伴随着艰难梭菌也消失了[24]，FMT不仅可以减少患者体内抗生素抗药基因的种类及数量，而且能清除大部分病原菌。动物刚出生时是菌群定殖的关键时期[25]，选择在雏鸡进入养殖场之前将对抗生素敏感的SPF鸡粪便菌群移植给新生雏鸡，使对抗生素敏感的菌群在雏鸡肠道定殖，对抗养殖场原有环境的抗药性菌群，是降低抗药性的可行途径。

展望粪菌移植在动物养殖中的应用，还有诸多问题，例如，如何筛选安全有效的供体，如何实现供体菌群的标准化及规模化制备，如何选择最佳接种方式，如何提高供体菌群在受体中的定殖效率，FMT非特异和特异治疗的机制研究等只有将这些因素研究透彻，才能使FMT的应用更加规范、有效。

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