小鼠骨髓源树突状细胞制备

王雪静

（贵州省兽药饲料监察所，贵阳 550003）

0 引言

1973年Steinman和Cohn首次分离出一类同巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞形态与功能不同的细胞，命名为树突状细胞(DCs)。其主要来源是骨髓CD34+多能造血干细胞，是体内唯一能直接激活初始T细胞的抗原提呈细胞(APC)[1]，是机体免疫的始动者及固有免疫和适应性免疫的桥梁。髓系树突状细胞通过血液与淋巴液从骨髓移动并分布到皮肤，后趋向淋巴组织启动免疫反应。淋巴系树突状细胞是T细胞集聚区的固定哨兵，分布主要局限在胸腺髓质及淋巴结T细胞区，具有免疫调节和免疫耐受作用。

当抗原性物质侵入机体时，宿主体内的免疫系统会启动一系列免疫防卫机制识别并清除病原体，特异性免疫应答启动前，需要APC摄取、加工、处理抗原并将抗原信息提呈给免疫应答的淋巴细胞。主要组织相容性复合物（MHC）是一段基因密度高的染色体区段，是一种复杂且多态性高的遗传系统。主要存在2个途径即溶酶体途径（MHC-Ⅱ类途径）和胞质溶胶途径（MHC-Ⅰ类途径）。另外，还存在MHC非依赖性的抗原提呈途径，称为CD1分子提呈途径。DCs的成熟经历前体期、幼稚期及成熟期3个时期。开始由骨髓进入血液循环，随后到达靶组织或器官，停留在潜在抗原物质出现位置，主要有MHC-I型和MHC-II型2种抗原提呈途径。

成熟DCs生物学特征有：能有效活化初始T细胞，有效摄取和处理抗原，CD80和CD11c可作为成熟DCs的标志，成熟DCs能启动免疫应答、释放干扰素等细胞因子等。DCs能摄取抗原并将其加工处理成能够被T细胞识别的多肽段。T细胞受体特异性识别抗原肽-MHC分子复合物，刺激T细胞活化，进而启动胞内信号转导，诱导细胞增殖和分化有关基因的表达。成熟T细胞主要包括CD4+T细胞（辅助T细胞）和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）2个亚群。免疫应答中，辅助T细胞最先激活，并释放细胞因子，激活巨噬细胞，诱导CTL成熟，促进细胞免疫应答，辅助B细胞产生抗体等。

树突状细胞主要来源有小鼠（或大鼠）脾脏、淋巴结、骨髓，人脐带血、外周血等。该试验制备的是小鼠的骨髓源树突状细胞（BMDCs）。实验室高纯度的小鼠骨髓树突状细胞的成功制备，为临床上治疗疾病奠定了基础。

1 设备与材料

1.1 主要仪器设备

（1）倒置相差显微镜37XB，购自上海光学仪器厂。

（2）电子天平FA-N/JA-N，购自上海民桥精密仪器公司。

（3）二氧化碳培养箱，购自BB15德国贺利氏公司。

1.2 试验材料

RPMI-1640（Invitrogen）、南美洲胎牛血清（Hyclone）、Mouse IFN-γ（R&D Systems）、Mouse IL-4（R&D Systems）、DMSO（Sigma）HEPES（Amresco）淋巴细胞分离液-小鼠（lympholyte-M）（上海普飞生物技术有限公司）

1.3 试验动物

BALB/c雄性小鼠（6～8周龄）购自河北医科大学实验动物中心，饲养于河北农业大学实验动物房，室温（23±2） ℃，供给全价饲料，自由采食、饮水。

2 试验方法

将小鼠脱颈处死，浸于75%的酒精中，无菌取其股骨，冲洗出其骨髓细胞，加入Tris-NH4Cl裂解液并室温作用5 min，裂解红细胞，用Hanks液冲洗2次，收集细胞。使用含10%胎牛血清，rmGM-CSF，IL-4的1640配成细胞悬液，接种在12孔培养板上，每孔1 mL，置于37 ℃的5%CO2培养箱中培养2～3 d。取出培养板，轻摇数次，弃去悬浮细胞，再缓慢加入1 mL1640完全培养液，轻晃数次，洗去残留非贴壁细胞。保留贴壁细胞的培养板中加入1640培养液继续培养，培养至第6天，半量换液并继续培养2 d；第8天，收集悬浮细胞即为小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）。

3 试验结果

用倒置相差显微镜观察并记录形状，结果表明：培养2～3 d时逐渐出现细胞集落，大部分贴壁，细胞逐渐增大而不规则；培养到4～5 d时，有部分BMDCs从集落上脱落悬浮于培养基中，有树突状形态的突起伸出；培养到6～7 d时，BMDCs逐渐从细胞集落上脱落，树突状形态明显，分叉增多。见图1。

培养7 d后，DCs已成熟，流式细胞仪检测证明[2]，CD11c、CD80、MHC高表达，CD11c作为BMDCs特异性表面分子，证明小鼠骨髓来源的单个核细胞体外诱导培养可以获得较高纯度的BMDCs。其细胞表面分子表达状况见图2。

图1 培养时间增加DCS的形态变化

图2 细胞表面分子鉴定图

负载FMDV VP1蛋白质的DC与T细胞按照1∶5的比例分别培养3、9、24、48 h后，收集共培养物上清液，用ELISA检测各组中IFN-γ的含量。结果见图3。

图3 各组中IFN-γ含量对比图

用SPSS软件统计分析，共培养3 h后，负载VP1蛋白质的DC与T细胞共培养组产生IFN-γ的量与两个对照组接近，差异不显著（P＞0.05）；共培养9 h后，负载VP1蛋白质的DC与T细胞共培养组产生的IFN-γ分别与对照组DC+T和DC相比，含量明显增高，差异极显著（P＜0.01）；共培养24、48 h后，负载VP1蛋白质的DC与T细胞共培养组产生IFN-γ的量也高于对照组DC+T和DC，差异显著（P＜0.05）。

由图3可知，在负载VP1蛋白质的DC活化淋巴结T细胞过程中，T细胞释放IFN-γ的量要明显高于对照组，表明负载FMDV VP1蛋白的DCs能够有效激活淋巴结T细胞，并表达高水平的IFN-γ，提取的DCs纯度较高。

4 结论

树突状细胞有能力刺激初始T细胞，使其具有向细胞毒性T细胞转化的功能，并介导肿瘤的清除；树突状细胞具有迁徙并浸入肿瘤的功能，因此可直接诱导潜在的T细胞发挥有效的免疫功能；树突状细胞可以同时提呈一系列不同抗原，引发全面的抗肿瘤免疫反应[3]。

对树突状细胞的研究，能更好的解决一些临床疾病。如研究树突状细胞最适于肿瘤的免疫治疗的类型，树突状细胞负载抗原能否适用于所有类型的肿瘤以及研究在临床移植中，利用树突状细胞的细胞免疫及免疫耐受治疗移植排斥及对抗病毒感染等。