E-选择素G98T位点基因多态性与乙肝HBV-DNA载量的相关性研究

郭清江

乙肝是目前全球范围内一个不容忽视的公共健康问题，患者往往乙肝病毒检测呈阳性，病程＞6个月或发病日期不明确但有临床症状表现[1]。全世界70%～80%的肝硬化以及肝癌患者是由乙肝发展而致，相关死亡人数则高达60万/年，且仍然处于上升态势[2]。由于该病症为多因素作用所致的感染性疾病，目前已知多种细胞因子基因多态性与其相关，如肿瘤坏死因子、白细胞介素等[3]。E-选择素是近年新出现的一种炎症细胞因子，其表达水平的升高将会介导炎症以及免疫细胞的浸润。当E-选择素基因第2外显子5′非翻译区98位点G发生突变时，引发G98T位点基因多态性，并对E-选择素表达水平产生直接影响，进一步增强后者所致的炎症反应及浸润能力。HBV-DNA载量可反映乙肝病毒的复制能力[4]。由于炎症反应在乙肝发生、发展中扮演着重要的角色，所以，有理由相信E-选择素G98T位点基因多态性与HBV-DNA载量之间存在着某种关联性，本研究对此进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 病例资料 选取医院2016年3月～2017年3月收治的80例乙肝患者作为观察组，其中男57例，女 23 例；年龄 38～64（50.24±1.16）岁；病程时间0.5～2.5（1.10±0.12）年；主要症状表现：肝区不适 11例，上腹部疼痛19例，乏力40例。纳入标准：（1）经临床诊断确诊为乙肝者；（2）民族为汉族；（3）同意此次研究方案并签署知情同意书者。排除标准：（1）甲、丙、丁、戊型肝炎者；（2）合并全身严重器质性疾病者；（3）混合或重叠感染者。另选同期于本院体检的80例健康体检者为对照组，其中男60例，女20例；年龄 40～65（50.25±1.15）岁。两组性别、年龄等一般资料比较差异不显著（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血液样本采集 观察组于住院第2 d上午6:00～8:00，对照组于体检当天上午6:00～8:00抽取空腹静脉血5 ml，置于促凝试管中，待血液彻底凝固后，2500 r/min离心10 min，采集血清，置于-20℃中备用。

1.2.2 E-选择素G98T位点基因多态性测定 首先进行E-选择素G98T位点基因DNA提取工作，吸取800 μl红细胞裂解液至容量为1.5 ml的离心管之中，取出冷冻的血液样本并恢复至室温状态，吸取400 μl样本至该离心管中倒置，轻弹管壁以促使二者充分混匀。在室温条件下静置10～15 min以待红细胞彻底裂解。以12 000 r/min离心30 s，去除上清液并留下白细胞团，涡旋振荡20 s后重悬处理，加入250 μl细胞核裂解液后用力吹打数次以促使白细胞充分裂解[5]。颠倒离心管10数次后加入100 μl蛋白沉淀液，涡旋振荡 30 s，以 13 000 r/min离心10 min，取一支无菌干净同规格的离心管，吸取上清液500 μl后置入该管，加入200 μl异丙醇（室温），适度用力混匀后以12 000 r/min离心60 s并去除上清液[6]。向其加入0.5 ml的70%乙醇，反复颠倒数次后漂洗处理以促使DNA沉淀，再次以相同转速离心60 s，去除上清液，残余乙醇自然风干。向由DNA提取的沉淀物之中加入100 μl溶解液，促使其重新水化后轻弹离心管壁以促使其混匀，于65℃孵育0.5～1 h[7]。最后利用1%琼脂糖凝胶电泳对DCA提取液进行定型鉴定，具体步骤如下：取10 ml溶液后加入上样缓冲液1 ml，适度用力混匀后置于电泳仪内，电压为130 V，待0.5 h后去除，并在凝胶成像仪下观察鉴定结果[8]。

1.2.3 E-选择素G98T位点基因组扩增 E-选择素G98T位点基因上下游引物的合成由上海生工生物有限公司完成，扩增条件设定为94℃预变性600 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s、35 个循环，完毕后 72 ℃延伸600 s，5℃下终止反应并保存，利用2%琼脂糖凝胶电泳显示结果[9]。随后于37℃下孵育10 h并进行限制性酶切处理，130 V电泳0.5 h，凝胶成像仪下鉴定基因型（AA型、AC型）。

1.2.4 HBV-DNA载量分析 利用豪夫迈.罗氏公司生产的Lightcycler 480荧光定量PCR仪对HBVDNA载量进行测定，检测试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供。

1.3 观察指标 将两组受试者E-选择素G98T位点基因型与基因频率、观察组内不同基因型HBVDNA载量、不同HBV-DNA载量基因型与基因频率作为观察指标。

1.4 统计学方法本研究中所有数据均应用SPSS17.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行t检验，计数资料用例和百分率表示，行χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组E-选择素G98T位点基因型与基因频率比较 两组E-选择素G98T位点基因型与基因频率相比较，观察组AA基因型占比、A等位基因频率低于对照组，AC基因型占比、C等位基因频率高于对照组（P＜ 0.05），见表 1。

表1 两组E-选择素G98T位点基因型与基因频率比较［n（%）］

2.2 观察组内不同基因型HBV-DNA载量 观察组内AA基因型患者HBV-DNA载量为（1.92±0.28）×103copy/ml，而 AC 基因型为（6.33±0.27）×103copy/ml，二者相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 观察组内不同HBV-DNA载量患者基因型与基因频率比较 依据HBV-DNA正常上限值（1×103copy/ml），＜1×103copy/ml者 AA 基因型占比及 A等位基因频率高于≥1×103copy/ml者，AC基因型占比、C等位基因频率低于≥1×103copy/ml者（P＜0.05），见表 2。

3 讨论

乙肝是目前全球范围内一个不可回避的公共卫生疾病，据统计全世界约有三分之一的人群既往或现在存在感染乙型病毒肝炎的血清学证据，3.5亿人成为乙肝病毒携带者，与之相关的终末期肝病或肝癌致死人数每年高达100万[10]。所以明确其发病机制并采取行之有效的干预措施与遏制乙肝发病率及病死率的过快增长成为当务之急[11]。现有研究指出，炎症细胞因子与乙肝的发生、发展存在着密切的关联性，而E-选择素则是目前医学界全新发现的一种炎性细胞因子，参与到了多种白细胞以及T淋巴细胞亚群的黏附与凝集，促使二者相互作用[12]。Lucio Boglione等[13]在其研究中证实，E-选择素表达水平的改变预示着细胞表明成分的翻转以及蛋白质的水解，在疾病早期活动之中发挥了至关重要的促进作用。尤其是随着分子生物学的快速发展，E-选择素基因多态性日益受到医学界的重视与关注。G98T位点基因多态性为E-选择素基因第2外显子5′非翻译区98位点G突变所致，该位点并不会直接翻译成蛋白质，但却能够通过对基因表达水平的直接调控来影响E-选择素的表达，使得后者介导的黏附凝集作用大幅增强，最终导致E-选择素表达水平上扬而引发炎症反应[14-15]。然而，E-选择素G98T位点基因多态性是否与乙肝的发生、发展存在相关性因现有研究较少，目前尚不得而知。所以，围绕此方面内容展开分析无疑具有重要的研究价值。

表2 观察组内不同HBV-DNA载量患者基因型与基因频率比较［n（%）］

本研究通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术对乙肝患者（观察组）以及健康体检者（对照组）E-选择素G98T位点基因多态性进行检测发现，两组E-选择素G98T位点基因型与基因频率相比较，观察组AA基因型占比、A等位基因频率低于对照组，AC基因型占比、C等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示E-选择素G98T位点基因多态性与乙型肝炎病毒感染之间存在着一定的关联性，等位基因C可能为慢性乙型肝炎的重要遗传易感因素。在HBV-DNA载量比较上，观察组内AA基因型患者HBV-DNA载量为（1.92±0.28）×103copy/ml，而 AC 基因型为（6.33±0.27）×103copy/ml，二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。依据HBV-DNA载量，依据HBV-DNA正常上限值（1×103copy/ml），＜1×103copy/ml AA 基因型占比及 A等位基因频率高于≥1×103copy/ml者，AC基因型占比、C等位基因频率低于≥1×103copy/ml者，差异亦有统计学意义（P＜0.05），提示临床AC位点多态性可能增强HBV-DNA复制能力。

综上所述，E-选择素G98T位点基因存在多态性，AC位点多态性可能增强HBV-DNA复制能力。