二甲双胍通过IGF-1R STAT3信号通路抑制前列腺癌生长的实验研究

蒋东方，卜 强，曾明辉，秦锁炳，夏东东，彭 毅

目前，前列腺癌发病率在全世界男性恶性肿瘤中位居第2[1]。随着我国逐步进入老龄社会，预计10年后前列腺癌的每年新发病例将达到60～70/10万[2]。与欧美国家不同，国人中约30%的前列腺癌患者初诊时已属侵袭性前列腺癌，手术机会少，预后差。因此，研究适合国情的前列腺癌个体化诊疗方案迫在眉睫。二甲双胍是广泛用于治疗2型糖尿病的双胍类药物。除了能降低血糖外，研究表明，二甲双胍在多种肿瘤中具有抗癌作用，能显著提高合并2型糖尿病的恶性肿瘤患者的生存率，其中包括前列腺癌[3-4]。大量研究证明，胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）在包括前列腺癌、乳腺癌、直肠癌等多种恶性肿瘤组织中异常高表达[5]。研究发现，前列腺癌细胞中的IGF-1R被上游信号通路激活后，自身的酪氨酸残基发生磷酸化[6]，从而促进癌细胞生长。目前二甲双胍对前列腺癌的作用及其相关机制尚未阐明，本研究通过建立小鼠前列腺癌肿瘤模型，分析IGF-1R/STAT3信号通路是否参与二甲双胍对前列腺癌细胞的抑制作用，探索二甲双胍抑制前列腺癌发生、发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 前列腺癌细胞株DU145由上海中科院细胞库提供，培养于含10%FBS的1640完全培养基中，37℃、5%C02、饱和湿度。取处于对数期生长的DU145细胞，加入0.25%胰酶消化3 min，1000 r/min离心3 min，弃上清，PBS洗涤细胞，用细胞计数板进行细胞计数，调整细胞浓度至2×107/ml。

1.2 前列腺癌小鼠模型的建立 18只雄性SPF级BALB/c裸鼠（4～6 w龄）购自中国医学科学院实验动物中心（动物合格证号：2008001658794），均饲养于恒温（25～27 ℃）、恒湿（25%～50%）和无特殊病原菌（SPF）条件下。于注射肿瘤细胞前，高糖饮食2 d，消毒裸鼠，用无菌套管针抽吸上述DU145细胞悬液200 μl，接种于实验鼠右腹股沟皮下，观察肿瘤生长情况。7 d后，将荷瘤裸鼠编号后，按不同处理方式随机分为对照组、二甲双胍组、PPP组，每组6只。对照组给予100 μl生理盐水，二甲双胍组给予50 μl生理盐水+50 μl二甲双胍（250 mg/kg），PPP 组给予 50 μl生 理 盐 水+50 μl 0.1 μM 鬼 柏 苦 （picropodophyllin，PPP），每日瘤内注射1次，每周称重小鼠。二甲双胍购自上海信谊药厂有限公司（国药准字H20050699），PPP购自Sigma-Aldrich公司。

1.3 检测指标

1.3.1 肿瘤生长情况 接种DU145细胞后3 w，处死小鼠，取出种植瘤并称质量。用游标卡尺测量肿瘤的长轴（L）和短轴（W），按公式 V=1/2×LW2计算肿瘤体积。肿瘤组织移至冻存管中，保存于液氮待用。同时观察实验过程中，小鼠的体重、饮食、活动等情况。

1.3.2 qRT-PCR检测IGF-1R和STAT3 mRNA肿瘤组织提取总RNA后，逆转录获得cDNA，逆转录试剂盒为PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit，购自大连宝生物公司。采用qR T-PCR进行mR NA定量分析，SYBRPremixExTaqII（TliR NaseHPlus）试剂盒购自大连宝生物公司；PCR引物由上海生工生物合成，序列如下，IGF1R：F：5'-ATGCTGTTTGAA C TGATGCGCA-3'，R：5'-GCCCCCGGCGTTCTTGCTC GCC-3'，354 bp；STAT3：F：5'-TTCTGGGCACAAACAC A AAAG-3'，R：5'-TCAGTCACAATCAGGGAAGC 3'，145 bp；GAPDH：F：5'-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'，R：5'-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3'，169 bp。 在ABI7500快速型实时定量PCR仪进行检测。根据PCR仪测得的 Ct值，使用 2-⊿⊿Ct法计算IGF-1R和STAT3 mR NA相对表达水平。

1.3.3 Western blot检测IGF-1R β和Stat3蛋白

提取肿瘤组织总蛋白，以GAPDH为内参，检测肿瘤组织中IGF1R、STAT3蛋白表达情况。一抗IGF-I R eceptor β （111A9）Mouse mAb、Stat3 （124H6）Mouse mAb（稀释比例 1:1000）和二抗 Anti-Mouse IgG，HR P-linkedAntibody（稀释比例1:5000）均购自CellSignaling Technology （CST）公司。 用 Image-Pro Plus软件分析各样品的目的蛋白、内参蛋白条带的灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。

1.3.4 ELISA检测血清IL-6和TNF-α 小鼠处死前，采集小鼠腹主动脉外周血2 ml，3000转/min离心5 min，收集血清，置于-80℃待用。采用双抗体夹心法检测IL-6和TNFVα ELISA水平，试剂盒购自Biolegend公司。

1.4 统计学方法应用SPSS17.0统计软件分析数据，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，采用LSD-t法进行两组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组肿瘤生长情况比较 在实验过程中，3组体重无明显差异（P＞0.05，表1），饮食及活动均正常，均表现出良好的耐受性。小鼠经不同处理3 w后，与对照组相比，二甲双胍组与PPP组的肿瘤大小、体积明显减小（P＜0.05），而二甲双胍组与PPP组间比较无显著差异（P＞0.05，表2）。

表2 各组肿瘤大小和体积比较

2.2 3组 IGF1R、Stat3蛋白和 IGF-1R、STAT3 mR NA表达水平比较 Western blot实验结果表明，二甲双胍能显著降低IGF-1R和Stat3蛋白的表达（P＜0.05），PPP组 IGF-1R和 Stat3表达量亦显著降低（P＜ 0.05，图 1）。

qPCR实验结果表明，二甲双胍组与PPP组的IGF1R、STAT3 mR NA表达显著低于对照组（P＜0.05），二甲双胍组STAT3 mR NA表达显著低于PPP组（P＜0.05），但二甲双胍组IGF1RmR NA显著高于PPP组（P＜0.05）。 见表3。

图1 Western blot电泳图

表1 各组不同处理后体重变化（g）

表33 组IGF1R、Stat3蛋白和IGF-1R、STAT3mRNA表达水平比较

2.3 3组血清IL-6和TNF-α水平比较 二甲双胍组血清IL-6显著低于对照组和PPP组（P＜0.05），对照组和PPP组IL-6比较无显著性差异（P＞0.05）；3组间 TNF-α 比较无显著差异（P＞ 0.05，表 4）。

表33 组血清IL-6和TNF-α水平比较

3 讨论

二甲双胍为一种胰岛素增敏剂，可改善患者的胰岛素抵抗，降低其体内高胰岛素血症。近年来研究发现，二甲双胍具有抗癌作用，其可能的抗癌机制是：激活AMP活化的蛋白激酶（AMPK），进而抑制mTOR通路活性[7]，抑制恶性胶质瘤的生长和转移；下调细胞周期蛋白D1，使卵巢肿瘤细胞有丝分裂受抑制[8]。二甲双胍通过介导AMPK减少肝脏糖异生，并刺激肌肉组织摄取葡萄糖，降低空腹血糖及胰岛素水平。在高胰岛素浓度的环境下，肿瘤细胞膜表面的胰岛素受体（IR）和IGF1R结合后，可激活下游ERK和PI3K等信号通路，促进肿瘤细胞的恶性进展[9]。IGF1和IGF2是正常机体组织中骨骼肌生长、分化的重要因子，然而研究表明，在多种肿瘤组织中存在IGF-1R的过表达现象，使得封闭IGF-1R活性的靶向治疗成为肿瘤治疗的研究热点。PPP是一种环木脂体，抗肿瘤活性天然产物鬼臼毒素的差位异构体，可通过抑制IGF-1R活性及其下游信号通路Akt、Erk 活化，从而诱导肿瘤细胞凋亡[10]，因此，在本实验中作为阳性对照。本研究结果显示，经二甲双胍和PPP处理后，小鼠前列腺肿瘤大小、体积明显缩小，证实二甲双胍具有抑制前列腺癌生长的作用，并且小鼠耐受性较好，表明二甲双胍和PPP较安全，毒性作用小。

二代抗雄激素药物恩杂鲁胺能显著抑制前列腺癌的进展，然而因恩杂鲁胺耐药的发生，导致其仅能延长患者4～6个月生存期。有研究显示，二甲双胍能增强恩杂鲁胺的抑制作用，可通过抑制恩杂鲁胺诱导的STAT3活化以及抑制TGF-β1表达，从而抑制上皮向间叶转化[11]。为进一步研究二甲双胍抑制前列腺癌生长的机制，本实验分析了IGF-1R/STAT3通路活化情况以及下游细胞因子代谢，探讨其是否参与二甲双胍抑制肿瘤的过程。PCR结果显示，二甲双胍和PPP能显著下调前列腺癌中IGF-1R、STAT3 mRNA的表达，其中PPP对IGF-1R的抑制作用强于二甲双胍。Western blot结果显示，二甲双胍和PPP处理后，肿瘤细胞IGF-1R、Stat3表达量亦显著降低，表明IGF-1R/STAT3通路在二甲双胍抑制前列腺癌生长过程中具有重要作用。

STAT3通路是IL-6、TNF-α的主要分子途径，参与调节细胞的生长、增殖和凋亡抵抗，IL-6、TNF-α表达水平异常与前列腺癌的进展有密切关联。本研究结果表明，二甲双胍可显著降低前列腺癌小鼠血清中IL-6的表达。

综上所述，二甲双胍可通过下调IGF-1R/STAT3信号通路以及IL-6的表达，有效抑制前列腺癌的生长，且二甲双胍经济、安全、毒性小，对前列腺癌的治疗作用值得深入研究。