消痔方醇提工艺和颗粒制剂含量测定方法

李成职 刘洋 刘小红 高华 孙世伟 侯玉雪 王威 刘坤

摘要： 为了制备临床经验消痔方的口服颗粒制剂，本文以大黄素和大黄酚总量及出膏率为评价指标，建立消痔方中熟大黄和秦艽药材的醇提工艺。采用平行试验法對消痔方中熟大黄和秦艽药材的提取次数进行选择，采用正交试验优选乙醇体积分数、乙醇用量和提取时间，优化出最佳醇提工艺为加6倍量70%的乙醇，回流提取3次，提取时间为3 h。颗粒制剂中大黄素和大黄酚的含量测定采用高效液相色谱法，色谱柱为Kramosil ODS（46 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-01%磷酸溶液（80∶20），流速为10 mL/min，检测波长为254 nm，大黄素和大黄酚进样量分别在0043 52～0217 60 μg和0089 6～0448 0 μg范围内，峰面积积分值与进样量呈线性关系（r=0999 9），平均加样回收率分别为9835%和10036%，相对标准偏差分别为207%和261%。该测定方法为消痔方口服固体医院制剂的研发提供了理论参考。

关键词： 消痔方颗粒； 提取工艺； 正交试验； 高效液相色谱法； 大黄素； 大黄酚

中图分类号： R284.2文献标识码： A

收稿日期： 20170912； 修回日期： 20171122

基金项目： 青岛市民生科技计划项目（159288nsh）

作者简介： 李成职（1982）， 硕士研究生， 主要研究方向为天然活性物质与创新药物。

通讯作者： 刘坤（1962）， 女， 教授， 主要研究方向为天然活性物质与创新药物。Email： kunliu62@126.com消痔方来自已故名老中医陆永昌主任医师的临床经验方，由熟大黄、秦艽、金银花、连翘、防风、郁金等9味药材配伍组成，诸药合用，具有清热解毒，行气化瘀，消肿止痛之功能，用于治疗因气滞血瘀兼湿热毒所致的痔疮[1]。原方以水煎汤剂应用于临床，但汤剂在煎煮过程中由于参数不量化造成的质量不稳定、服用顺应性差、携带不方便、不易保存、需临用新制等缺点，本文拟选用在汤剂基础上提取颗粒剂为消痔方剂型[23]。消痔方中大黄的有效成分为蒽醌类化合物，秦艽的有效成分为环烯醚萜苷类化合物，现代药理学研究结果表明，大黄所含的蒽醌类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、泻下等作用[49]，秦艽所含的环烯醚萜苷类化合物具有抗炎、止痛等作用[911]，因此，建立科学合理的提取工艺和质量标准是医院制剂开发的关键环节。本研究以大黄素和大黄酚总量、出膏率为评价指标，采用平行试验法优化消痔方中熟大黄和秦艽药材提取次数，正交试验法优化乙醇体积分数、乙醇用量和提取时间，利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定消痔方颗粒制剂中大黄素和大黄酚的含量。该研究为消痔方口服固体医院制剂的研发提供参考，具有一定的实用价值。

1实验

1.1仪器与材料

仪器：LC20AT输液泵，SPDM20A二极管阵列检测器，LC solution色谱工作站（日本岛津制作所）；AL104分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；色谱柱Kromasil ODS（46 mm×250 mm，5 μm，瑞典阿克苏诺贝尔公司）；电子恒温水浴锅（上海科仪实验仪器厂）；Dz*2BC型真空干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）。

材料：痔疮方提取用药购于安徽毫州市永刚饮片有限公司，符合中国药典规定标准。大黄素对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号20131203）；大黄酚对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号20130320）；甲醇为色谱纯（美国天地有限公司）；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1提取工艺研究

1）提取次数的选择。称取熟大黄30 g，秦艽20 g，加入6倍量70%的乙醇，回流提取4次，每次2 h，对提表1因素水平表

水平乙醇体积

分数A/%加醇量

B/倍提取时间

C/min15036027061203909180取液进行收集、浓缩，定容于100 mL量瓶中作为样品溶液，最后测定大黄素和大黄酚总量和出膏率。

2）乙醇体积分数、乙醇用量和提取时间的选择。分3个水平对影响因素乙醇体积分数、乙醇用量和提取时间进行正交试验优选，因素水平如表1所示。称取熟大黄30 g、秦艽20 g各9份，分别按表1加入相应倍量不同体积分数的乙醇回流提取3次，每次提取相应时间，提取液分次滤过、合并、浓缩，分别用相应溶剂定容于100 mL量瓶中作为样品溶液，最后测定大黄素和大黄酚总量及出膏率。

1.2.2测定方法[1215]

1.2.2.1出膏率的测定

量取样品溶液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，置于干燥器中，冷却30 min后称重，计算出膏率。

1.2.2.2大黄素与大黄酚含量测定

1）色谱条件。色谱柱为Kramosil ODS（46 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-01%磷酸溶液（80∶20），流速为10 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为室温。

2）大黄素对照品溶液制备。精密称取大黄素对照品适量，加甲醇制成质量浓度为544 μg/mL的溶液。

3）大黄酚对照品溶液制备。精密称取大黄酚对照品适量，加甲醇制成质量浓度为1120 μg/mL的溶液。

4）提取样品供试品溶液制备。精密量取提取样品溶液10～40 mL，蒸干，向残渣中加水20 mL和盐酸2 mL使其溶解，加热回流1 h，取出，立即冷却，用乙醚120 mL分6次萃取，萃取液蒸干，残渣用甲醇定容于100 mL量瓶中，滤过，精密量取续滤液50 mL，定容于25 mL量瓶中，即得。

5）颗粒制剂供试品溶液制备。取本品内容物，研细，取约25 g，精密称定，用甲醇索氏回流提取至提取液无色，蒸干，残渣加水20 mL和盐酸2 mL使其溶解，加热回流1 h，取出，立即冷却，用乙醚120 mL分6次萃取，萃取液蒸干，残渣用甲醇定容于100 mL量瓶中，滤过，精密量取续滤液50 mL，定容于10 mL量瓶中，即得。

6）测定法。分别精密吸取大黄素和大黄酚对照品溶液及供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，利用外标一点法计算大黄素和大黄酚的含量。

2实验结果与分析

2.1提取次数的选择

采用平行实验法对提取次数进行选择，提取次数对提取量的影响结果如表2所示。由表2可以看出，当提取3次时，浸膏量占总浸膏量的9426%，大黄素与大黄酚之和占总大黄素与大黄酚提取量的9923%。按生药计算，大黄素与大黄酚的转移率为8047%，因此选择提取次数为3次。

5157.487 09332111.509 530.092 45223117.214 5184.381 5采用SPSS 170软件分别对出膏率、大黄素和大黄酚提取量作方差分析和极差分析，出膏量极差分析结果如表4所示，大黄素和大黄酚提取量极差分析结果如表5所示。由表4可以看出，各因素对醇提工艺出膏量影响程度大小依次为A>B>C；由表5可以看出，各因素对醇提工艺大黄素和大黄酚提取量影响程度大小依次为A>C>B。出膏量方差分析结果如表6所示，大黄素和大黄酚提取量方差分析结果如表7所示。由表6和表7可以看出，对醇提工艺有显著性影响因素为乙醇体积分数，加醇量和提取时间对醇提工艺无显著性影响。综上分析，优选出理论最佳提取工艺为A2B2C3，即6倍量70%的乙醇提取3次，每次提取时间为3 h。

2）线性关系考察。精密称取大黄素对照品，加甲醇制成质量浓度为1088 μg/mL的溶液，精密吸取10，20，30，40，50 mL，分别置于50 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标，大黄素进样量为横坐标进行线性回归。结果表明，大黄素进样量在0043 52～0217 60 μg范围内，峰面积积分值与大黄素进样量呈线性关系，回归方程为Y=1 822 461X-231，相关系数r=0999 9。精密称取大黄酚对照品，加甲醇制成质量浓度为560 μg/mL的溶液，精密吸取20，40，60，80，100 mL，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标，大黄酚进样量为横坐标进行线性回归。结果表明，大黄酚进样量在0089 6～0448 0 μg范围内，峰面积积分值与大黄酚量呈线性关系，回归方程为Y=2 380 069X-13 435，相关系数r=0999 9。

3）重复性實验。精密吸取同一供试品溶液连续进样6次，每次20 μL，测定大黄素与大黄酚峰面积积分值，相对标准偏差分别为019%和024%。

4）稳定性实验。取同一供试品溶液，在室温下分别于0，2，4，6，8 h，按照122中2）的方法测定。测定结果表明，在8 h内，供试品溶液中大黄素与大黄酚的含量基本无变化，相对标准偏差分别为023%和053%。

5）重现性实验。取同一批号供试品6份，按照1222中的方法测定，测得大黄素与大黄酚的平均含量分别为0164 0 mg/g和0966 5 mg/g，相对标准偏差分别为226%和156%。

6）准确度实验。精密称取大黄素含量0164 0 mg/g，大黄酚含量0966 5 mg/g的供试品5份，每份125 g，置索氏提取器中，分别加入质量浓度的0109 mg/mL的大黄素对照品溶液20 mL，质量浓度0582 mg/mL的大黄酚对照品溶液20 mL，挥干溶剂，按1222中的方法测定，大黄素和大黄酚加样回收率测定结果如表8和表9所示。由表8可以看出，大黄素平均加样回收率为9835%，相对标准偏差为207%；由表9可以看出，大黄酚平均加样回收率为10036%，相对标准偏差为261%。

结束语

目前痔疮的治疗以非手术治疗为主，但市场上销售的用于痔疮治疗药物多为外用制剂。口服方剂痔疮方为已故全国首批名老中医陆永昌主任医师治疗气滞血瘀兼湿热毒所致混合痔的临床经验方，建立科学合理的提取工艺和质量标准是医院制剂开发的关键环节。本研究建立的消痔方中熟大黄和秦艽药材的醇提工艺和颗粒制剂中大黄素和大黄酚的含量测定方法，为消痔方口服固体医院制剂的研发提供参考。在此基础上，下一步研究方向是开展消痔方颗粒制剂抗炎、止痛、止血等药效学研究进而评价提取工艺的可行性。

参考文献：

[1]陆维娜， 陆峰. 陆永昌[M]. 北京： 中国中医药出版社， 2007.

[2]陈大业， 刘文. 运脾颗粒成型工艺、临界相对湿度和质量标准提取工艺的考察[J]. 贵阳中医学院学报， 2017， 39（1）： 3237.

[3]汪铜芳， 张咏梅， 李珊珊， 等. 心脑苏颗粒成型工艺优选[J]. 世界中医药， 2017， 12（2）： 411413.

[4]傅兴圣， 陈菲， 刘训红， 等.大黄化学成分与药理作用研究新进展[J].中国新药杂志， 2011， 20（16）： 15341538.

[5]徐佑东， 张艳， 孟宪丽， 等. 基于反向对接法的大黄酸抗炎作用的分子机制 [J]. 四川生理科学杂志， 2016， 38（1）： 14.

[6]胡永淑. 大黄炮制前后物质基础变化研究 [J]. 中国药房， 2014， 25（11）： 10161018.

[7]梁荣感， 罗伟生， 李利亚， 等. 大黄蒽醌类化合物体外抗流感病毒作用的研究 [J]. 华夏医学， 2006， 19（3）： 396398.

[8]赵瑞芝， 欧润妹， 章新生， 等. 不同提取方法对大黄游离蒽醌含量及抑菌活性影响研究 [J]. 中国药学杂志， 2001， 36（7）： 483484.

[9]芦启琴， 娄灯吉， 沈建伟， 等. 秦艽化学成分及药理作用研究进展[J]. 安徽农业科学， 2007， 35（29）： 92999301.

[10]聂继红， 张海英， 郭亭亭. 中药秦艽抗炎镇痛作用的实验研究[J]. 中国现代医药杂志， 2010， 12（12）： 1214.

[11]陈长勋， 刘占文， 孙峥嵘， 等. 龙胆苦苷抗炎药理作用研究[J]. 中草药， 2003， 34（9）： 814816.

[12]杨洁， 孟楣， 王晓玉， 等. 四味黄连洗剂中大黄素和大黄酚的含量测定方法研究[J]. 安徽医药， 2017， 21（6）： 10061009.

[13]乌仁图雅， 萨日盖， 萨茹拉， 等. 不同产地民族药材大黄中蒽醌类成分的含量对比研究 [J]. 中国民族医药杂志， 2017， 23（6）： 4142.

[14]王俊丽， 李加恒， 胡中慧， 等. HPLC法测定润通茶中大黄素和大黄酚的含量 [J]. 西北国防医学杂志， 2017， 38（8）： 494496.

[15]檀巧婷， 黄爱文， 李蔚， 等. 润通茶质量标准研究 [J]. 解放军药学学报， 2016， 32（3）： 233235.