血清4型I亚群禽腺病毒高免卵黄抗体的制备与应用

魏中锋 杜卫宾 徐梅

摘要：本研究利用分离鉴定的FadV-4（SD株），制备FadV-4（SD株）油乳剂灭活疫苗并制备卵黄杭体，通过对该卵黄杭体的安全性和预防与治疗效果进行了研究，本研究的临床试验结果表明卵黄杭体对FadV-4感染的预防保护率高达98.67%，对FadV-4感染的治疗率高达97.33%，卵黄杭体对临床中FadV-4的感染具有良好的预防与治疗效果，可用于鸡场鸡安卡拉病的保健和治疗。

关键词：禽;腺病毒;卵黄抗体;制备;应用

中图分类号：S851 文献标识码：A 文章编号：2095-9737（2018）10-0001-03

由血清4型工亚群禽腺病毒（FadV-4）引起的鸡安卡拉病是近年来在我国出现的以心包积液、包涵体肝炎为主要特征的一种急性、烈性传染病，该病传播速度快、病死率高，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。由于目前尚无特效治疗药物，多数养殖单位采用抗病毒药物来预防与治疗鸡安卡拉病，浪费巨大人力和物力的同时也导致预防和治疗效果并不理想。卵黄抗体（IgY）又称为卵黄免疫球蛋白，是血液中的特异性抗体在卵细胞中逐渐蓄积而形成，将卵黄中的抗体经过提取处理后即可用于相应疾病的预防和治疗，且具有成本低、产量高、安全高效、性能稳定、可规模化连续生产等优点，克服了血清抗体（IgG）成本高、非特异性反应、无法连续生产等缺点，近年来在动物疫病防控中得到了廣泛应用[1]。

1 材料

1.1 毒株与疫苗

FadV-4（SD株）由本实验室分离鉴定并保存;FadV-4（SD株）油乳剂灭活疫苗由本实验室制备并保存。

1.2 试验动物

无疫病感染史和禽腺病毒免疫史的健康产蛋鸡30只购自菏泽市军英养殖场;300只健康AA+自羽肉仔鸡由菏泽兴君种禽场提供。

1.3 主要试剂

辛酸均购自成都东金化学试剂厂;白油购自淄博嘉驰石油化工有限公司;硬脂酸铝、司本-80、吐温-80均购自成都东金化学试剂厂。

2 方法

2.1 产蛋鸡的免疫

基础免疫，取产蛋鸡20只，于腿部肌肉多点注射FadV-4（SD株）油乳剂灭活疫苗0.2mL/只。加强免疫，于首免后21天进行二免，腿部肌肉多点注射FadV-4 （SD株）油乳剂灭活疫苗0.3mL/只。强化免疫，于二免后21天进行三免，腿部肌肉多点注射FadV-4 （SD株）油乳剂灭活疫苗0.5mL/只。维持免疫，于三免后每隔60天进行维持免疫，腿部肌肉多点注射FadV-4 （SD株）油乳剂灭活疫苗0.5mL/只。同时取10只产蛋鸡作为对照组，同时于腿部肌肉多点注射同剂量的灭菌生理盐水。

2.2 鸡血清FadV-4杭体效价监测

于首次免疫后7天、14天、21天、28天、60天、120天、180天分别对所有试验鸡于翅静脉采集血清1.0mL，常规方法分离血清。以10倍浓缩的FadV-4（SD株）灭活抗原为检测抗原，采用琼脂扩散方法分别测定免疫组和对照组蛋鸡的血清抗体效价（1092）。

2.3 鸡蛋FadV-4杭体效价监测

于首次免疫后7天、14天、21天、28天、60天、120天、180天分别采集免疫组和对照组的鸡蛋，将蛋壳表面用酒精棉球擦拭清洁，打开蛋壳，取出蛋黄，加入2倍体积的灭菌生理盐水，震荡混合均匀后加入等体积的氯仿，震荡混合均匀，12000 r/min离心10min后，吸取上清液即得卵黄抗体。以10倍浓缩的FadV-4（SD株）灭活抗原为检测抗原，采用琼脂扩散试验方法分别测定免疫组和对照组蛋鸡的卵黄抗体效价。

2.4 卵黄抗体的制备

采集琼脂扩散试验方法测定抗体效价在5log₂以上的鸡蛋，将鸡蛋浸入0.1%二氯异氰尿酸钠水溶液中消毒15min，打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，分离卵黄。将卵黄移至灭菌容器内，加入其7倍体积的醋酸盐缓冲液（0.12 mol/L，pH值5.0），搅拌混合均匀，将pH值调至5.2，置2-8℃静止过夜。次日吸取上清液，缓慢搅拌加入辛酸至终浓度为1.5%，搅拌混合均匀，置2～8℃静止过夜。次日取上清液，将pH值调至7.2。取卵黄液经0.45μm滤膜过滤澄清，在滤液中缓慢滴人甲醛至甲醛溶液终浓度为0.05%，于室温灭活24h，分装后2～8℃保存。

2.5 卵黄杭体的检验

按照《中华人民共和国兽药典》三部2015年版（中国兽药典委员会编，2015）中的方法进行无菌检验、物理性状检验、甲醛残留量测定、辛酸残留量测定、支原体检验、外源病毒检验、安全性检验、效力检验和抗体效价检测等常规检验。同时进行雏鸡预防保护试验。

2.6 临床应用效果研究

2.6.1 卵黄抗体对FadV-4的预防效果

将300只3日龄健康AA+自羽肉仔鸡随机分成2组（对照组和免疫组），每组150只鸡，免疫组每只肉仔鸡皮下注射卵黄抗体0.5mL，对照组每只肉仔鸡皮下注射灭菌生注射FadV-4 （SD株）病毒液，0.1mL/只，隔离饲养，观察至14天，统计各组鸡的发病数和死亡数，分析卵黄抗体对肉仔鸡人工感染FadV-4的预防效果。

2.6.2 卵黄抗体对FadV-4感染肉仔鸡的治疗效果

将300只3日龄健康AA+自羽肉仔鸡随机分成2组（对照组和治疗组），每组150只鸡，对照组和治疗组鸡均腿部肌肉注射FadV-4（SD株）病毒液，0.1mL/只，注射后3天，治疗组每只肉仔鸡皮下注射卵黄抗体0.5mL，对照组每只肉仔鸡皮下注射灭菌生理盐水0.5mL，隔离饲养，观察至14天，统计各组鸡的死亡数和治愈数，分析卵黄抗体对肉仔鸡人工感染FadV-4的治疗效果。

3 结果

3.1 免疫鸡血清抗体效价测定结果

如图1所示，在疫苗免疫后，免疫组蛋鸡血清FadV-4抗体效价逐渐提高，至首次免疫后90天抗体效价达到峰值（8.1log2 ），随后开始维持在一定水平，至免疫后180天，FadV-4抗体效价仍维持在7.5log2以上。

3.2 免疫鸡卵黄抗体效价测定结果

如图2所示，在疫苗免疫后，免疫组蛋鸡卵黄中FadV-4抗体效价逐渐提高，至首次免疫后90天抗体效价达到峰值（7.2log2 ），随后开始维持在一定水平，至免疫后180天，抗体消长规律与卵黄抗体消长规律基本一致，但卵黄抗体的增长趋势较血清抗体迟3～5天，且峰值水平较血清抗体约低1个滴度，这可能是血清中抗体逐步转移至卵黄的结果。

3.3 卵黄杭体的检验

3.3.1 常规检验结果

按照《中华人民共和国兽药典》三部2015年版中的方法进行检验，卵黄抗体无菌生长;卵黄抗体为淡黄色澄明液体，久置后具有少量白色沉淀;卵黄抗体的甲醛残留量为0.091%;卵黄抗体的辛酸残留量<0.1%辛酸标准溶液A440;无支原体生长;无外源病毒污染;注射卵黄抗体未引起1日龄SPF鸡的任何局部或全身不良反应;采用琼脂扩散试验方法测定卵黄抗体的抗体效价为6log2。

3.3.2 雏鸡预防保护试验结果

如表1所示，对照组鸡在攻毒后，先后表现出食欲减退、精神萎靡等临床表现，至攻毒后5天，攻毒对照组10只鸡已全部死亡，剖检死亡鸡可见心包积液以及肝脏出血、肿大、变性、坏死等FadV-4感染的典型病理变化。卵黄抗体组鸡在攻毒后14天内均未表现出食欲减退、精神萎靡等临床表现，至14天，将试验鸡宰杀、解剖，内脏器官未见任何病理变化。表明卵黄抗体0.5mL的免疫剂量在免疫后5天内能完全保护FadV-4强毒株的攻击，卵黄抗体的预防效果较好。

3.4.1 卵黄抗体对FadV-4的预防效果

如表2所示，免疫5天后，攻击FadV-4（SD株），观察至14天，卵黄抗体免疫组的150只肉仔鸡存活148只，对照预防保护率高达98.67%。表明本研究制备的卵黄抗体能够有效预防临床中FadV-4的感染。

3.4.2 卵黄抗体对FadV-4感染肉仔鸡的治疗效果

如表3所示，人工感染FadV-4（SD株）3天后，分别注射灭菌生理盐水和卵黄抗体作为治疗药物，观察至14天，卵黄抗体治疗组的150只肉仔鸡存活146只，对照组的150只肉仔鸡死亡147只，卵黄抗体对FadV-4感染的治疗率高达97.33%。表明本研究制备的卵黄抗体对临床中FadV-4的感染具有良好的治疗效果。

4 讨论

4.1 卵黄抗体的优越性

卵黄抗体（IgY）又称为卵黄免疫球蛋白，是禽类血清中免疫球蛋白G（IgG）移行至卵黄中形成的多克隆抗体[2]，本研究的卵黄抗体化学性质稳定，与血清抗体相比较具有成本低、易于制备、可规模化生产、可连续性生产等优点，其通过被动免疫可使免疫动物获得坚实的保护力，是疫病预防和治疗的良好兽用生物制品，在动物疫病防控中将具有广阔的应用前景。

4.2 琼脂扩散试验检测方法的建立

琼脂扩散试验（AGP）是通过可溶性抗原与相应抗体在琼脂凝胶中自由扩散，当抗原和抗体发生特异性反应后形成肉眼可见的自色沉淀线，如抗原和抗体不发生特异性反应则不会出现沉淀线，可用于抗原或抗体的定性检测[3]。琼脂扩散试验为经典的抗原抗体检测方法，虽然敏感性和特异性落后于ELISA等免疫学检测方法，但具有试验成本低廉，操作简单，特别适合于基层应用等优点。本研究经过前期反应条件的不断优化，最后表明10倍浓缩的FadV-4灭活抗原作为检测抗原时，其检测结果易于观察。

4.3 卵黄杭体提取方法的选择

卵黄的主要成分为蛋白质和脂类，其中以脂蛋白占大部分，而抗体为水溶性蛋白，卵黄抗体的提取就是将卵黄中抗体和其他成分分离，从而去除脂类成分，保留水溶性的卵黄抗体[4]。本研究选择辛酸提取法对卵黄抗体进行了提取，后期检验表明提取后的卵黄抗体具有良好的抗体效价与预防治疗效果，取得了理想的试验结果。

4.4 卵黄杭体检验项目的选择

由于目前国内尚无商品化的鸡安卡拉病卵黄抗体，也无鸡安卡拉病卵黄抗体的制造与检验操作规程，而卵黄抗体的检验是卵黄抗体安全与有效的保障，对卵黄抗体的临床应用至关重要。本研究通过对制备的FadV-4（SD株）卵黄抗体进行无菌检验、物理性状检验、甲醛残留量测定、辛酸残留量测定、支原体检验、外源病毒检验、安全性检验、效力检验等常规检验，且检验结果表明本研究制备的FadV-4（SD株）卵黄抗体能够达到国家对禽类病毒病卵黄抗体同类产品质量的标准要求，为FadV-4（SD株）卵黄抗体的临床推广应用提供了质量保障。

4.5 卵黄杭体的应用效果

本研究的临床应用试验结果表明卵黄抗体对FadV-4感染的预防保护率高达98.67%，对FadV-4感染的治疗率高达97.33%，卵黄抗体对临床中FadV-4的感染具有良好的预防与治疗效果，可用于鸡场鸡安卡拉病的保健和治疗。为我国鸡安卡拉病的预防与治疗提供了一种快速、简单、安全、有效的技术手段，将具有很好的推广和应用前景，对于逐步降低我国鸡安卡拉病的感染率、保障我國养禽业的健康与快速发展将具有十分重要的现实意义。

参考文献：

[1]亓秀晔，宋翔，王业华，等.卵黄抗体在疾病防治中的应用[J].中国动物传染病学报，2017，25（5）：80-86.

[2]孙丽娜，孙万邦.卵黄抗体的结构与功能其在人及动物疾病中应用进展[J].中国人兽共患病学报，2018，34（1）：1 -10.

[3]张莹辉，吴思捷，薛麒，等.卵黄抗体三种提取方法的比较研究[J].中国兽药杂志，2015，49（8）：51 -54.

[4]刘坤洋.琼脂扩散试验的影响因素及注意事项[J].新农业，2015（9）：50.